重组葡激酶(r-Sak)工程菌发酵工艺的研究

通过对影响重组葡激酶表达的几个主要因素的研究，建立了较为适宜的发酵条件：接种量4%；初始pH7.2；在A600nm=2.5时加20%蔗糖诱导，诱导后4～5h收获，发酵液上清r-Sak含量可达到250mg/L以上，酶活力可达到6500RU/ml以上。     

Keratinase production and keratin degradation by a mutant strain of Bacillus subtilis

A new feather-degrading bacterium was isolated from a local feather waste site and identified as Bacillus subtilis based on morphological, physiochemical, and phylogenetic characteristics. Screening for mutants with elevated keratinolytic activity using N-methyl-N＇-nitro-N-nitrosoguanidine mutagenesis resulted in a mutant strain KD-N2 producing keratinolytic activity about 2.5 times that of the wild-type strain. The mutant strain produced inducible keratinase in different substrates of feathers, hair, wool and silk under submerged cultivation. Scanning electron microscopy studies showed the degradation of feathers, hair and silk by the keratinase. The optimal conditions for keratinase production include initial pH of 7.5, inoculum size of 2% （v/v）, age of inoculum of 16 h, and cultivation at 23 ℃. The maximum keratinolytic activity of KD-N2 was achieved after 30 h. Essential amino acids like threonine, valine, methionine as well as ammonia were produced when feathers were used as substrates. Strain KD-N2, therefore, shows great promise of finding potential applications in keratin hydrolysis and keratinase production.     

细菌科间原生质体融合方法的研究

本文通过对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)151衍生株和北京棒杆菌(Corynebacterium pekinese)1134衍生株的科间原生质体融合的研究以及灭活原生质体的科间融合的研究,揭示了细菌科间原生质体融合的可能性,同时进行了不同融合方法的分析对比,为今后工业微生物的远缘育种提供了可以选择的有效途径和理论依据。     

枯草芽孢杆菌XF-1的碳水化合物活性酶类(CAZymes)蛋白预测与遗传关系分析

枯草芽孢杆菌XF-1对多种植物病原菌具有较好的抑制作用,是农业生产上非常重要的生防菌之一.碳水化合物活性酶类蛋白(CAZymes)作为植物病原真菌、细菌中重要的蛋白,在其生长和发育过程中发挥着重要作用.基于前期获得的枯草芽孢杆菌XF-1中104个分泌蛋白基本序列信息,利用CAT预测程序对该菌中的CAZymes蛋白进行预测分析,明确其含有CAZymes蛋白的数量是58个,上述蛋白可以分为主要类别和复合类别两大类,前者包括26个GHs、21个CBMs以及2个CEs、3个PLs、2个GTs;后者则包括4个复合蛋白类型GH/CBM.该研究有效地实现了枯草芽孢杆菌XF-1中CAZymes的预测,为进一步开展其功能研究打下坚实的理论基础.     

水解胶原蛋白对枯草芽胞杆菌生长的影响

本文测定了不同氮源(水解胶原蛋白CH、蛋白胨、明胶、硝酸钠、氯化铵)对枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)生长的影响;考察了CH和玉米浆的不同配比对枯草芽胞杆菌生长的影响;研究以CH为氮源时,不同碳源对枯草芽胞杆菌生长的影响;考查CH对其它细菌发酵的影响.研究发现,在CH为氮源条件下,枯草芽胞杆菌的发酵过程可顺利进行,且微生物的生物量可保持在较高水平;同玉米浆相比,CH能使枯草芽胞杆菌达到较高的生物量;以CH为氮源时,淀粉比葡萄糖、蔗糖更有利于枯草芽胞杆菌的生长;除了枯草芽胞杆菌以外,大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 15489)和地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis CICC 20031)也能有效利用CH.这表明,在实验条件下水解胶原蛋白(CH)可以作为多种微生物发酵的氮源.     

绿色糖单孢菌麦芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达

【目的】构建高产麦芽糖α-淀粉酶的工程菌株并实现高效分泌表达。【方法】PCR扩增麦芽糖α-淀粉酶基因sva,再与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌麦芽糖诱导型穿梭载体pHCMCO4-Pglv连接,构建重组质粒pHCMCO4-Pglv-sva并转入枯草芽孢杆菌进行表达,对重组酶进行SDS-PAGE分析,然后对重组菌株的生长及发酵条件进行优化。【结果】成功构建重组质粒pHCMCO4-Pglv-sva并在枯草芽孢杆菌中实现分泌表达,SDS-PAGE分析发现,在55kDa处得到特异性蛋白条带。单因素试验结果显示,重组菌的最适诱导温度为35℃,最适接种量为4%(V/V),最适装液量为30mL。正交实验结果显示,重组菌的最佳发酵条件组合是诱导温度37℃、接种量5%(V/V)、装液量25mL,在此条件下发酵液粗酶活力达到257.3698U/mL。装液量对重组菌的产酶量影响显著。【结论】成功构建能高效分泌表达麦芽糖α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌株,经发酵条件优化后,重组酶产量显著提高10倍左右。     

一株高温产表面活性剂菌的筛选及性能评价

从油田产出水中筛选出一株能在75℃条件下产生表面活性剂的高温菌,经形态、生理生化特征及Biolog微生物自动鉴定仪鉴定,该菌为枯草芽孢杆菌.生物表面活性剂的临界胶束质量浓度CMC为130mg/L.对其激活条件进行优化,优化结果为:该菌最佳碳源、氮源和最佳盐度分别为花生油、酵母膏和质量分数0.5%的NaCl.用该菌株在模拟75℃高温油藏条件下进行物模驱油实验,结果表明:在培养10d后可提高采收率4.5%.菌株B-1在微生物采油中具有很好的应用前景.     

强电离放电·OH致死有害细菌的实验

采用喷嘴对·OH进行载体喷雾定量杀菌实验,研究·OH的衰减程度及其对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌黑色变种的灭活作用;并通过测定不同浓度.OH对细菌作用后产生的脂质过氧化物量和蛋白质漏出量,研究了.OH对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌黑色变种细胞损伤的情况.结果表明:应用椎型喷嘴(孔径3.18 mm,水压0.49 MPa)和扇型扇形喷嘴(孔径3.57 mm,水压0.63 MPa)喷雾后的雾滴粒径可以有效地降低.OH衰减,对有害细菌的杀灭率都可达到《消毒技术规范》要求.     

内生枯草芽孢杆菌HD-1β-甘露聚糖酶基因的克隆及结构生物学分析

采用PCR技术从一株内生枯草芽孢杆菌HD-1基因组DNA中扩增出β-甘露聚糖酶基因核苷酸编码序列.序列分析表明,该基因全长1 089bp,编码362个氨基酸和一个终止密码子,N端前27个氨基酸为其信号肽.该酶氨基酸序列与相同来源的β-甘露糖苷酶同源性最高达98.34%,具有ManB保守结构域,属于糖苷水解酶家族26的一员.通过对该酶分子三维结构的预测分析,该酶的催化域形成TIM桶状结构,Cys92和Cys112形成二硫键,它们之间的部分构成该酶的氧化还原反应的活性中心,Glu100和Glu292分别为该酶的酸碱催化位点和亲核催化位点.三维结构的分析为提高酶的催化活性的和功能方面的定向改造提供了依据.     

产环氧化物水解酶菌种的筛选及发酵条件优化

以外消旋苯基环氧乙烷为唯一碳源,从土壤中筛选出编号为G7的菌株,能选择性水解外消旋苯基环氧乙烷而得到(S)-苯基环氧乙烷,对映体过量值(e.e)达到99.3%。经鉴定菌种G7属于枯草芽胞杆菌。对该菌株的发酵条件进行了优化,结果表明,当培养基成分为蔗糖10g/L,胰蛋白胨10g/L,Na₂HPO₄·12H₂O 2g/L,KH₂PO₄ 2g/L,MgSO₄ 0.2g/L,CaCl₂ 0.01g/L,pH 6.5,30℃培养25h,环氧化物水解酶活力达到最高值372.2U/mg。