真菌嵌合体植酸酶的构建及其抗蛋白酶水解特性研究

 在烟曲霉植酸酶（Afp）的基因上,通过PCR逐步将编码1-47、178-237及338-381多肽序列的DNA片段置换为黑曲霉NRRL 3135植酸酶（Anp）中的对应片段,构建了3个嵌合体（嵌合体Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ）基因,并在毕赤酵母中将其成功表达及纯化。所有的嵌合体和亲本植酸酶均能抵抗胃蛋白酶。在m(胰蛋白酶)/m(植酸酶)为0.1时,Anp完全失活;但Afp与所有嵌合体的活性仅损失13%~23%。胰蛋白酶水解产物的SDS-PAGE结果显示嵌合体Ⅱ与Ⅲ也能被胰蛋白酶严重水解,但非变性PAGE结果却表明它们在水解后仍能保持结构完整。嵌合体也具有一些与Anp及Afp相异的新pH曲线及耐热性。实验表明,通过替换基因片段改良真菌植酸酶可行。     

Improvement of xylanase production by Aspergillus niger XY-1 using response surface methodology for optimizing the medium composition

Objective： To study the optimal medium composition for xylanase production by Aspergillus niger XY-1 in solid-state fermentation （SSF）. Methods： Statistical methodology including the Plackett-Burman design （PBD） and the central composite design （CCD） was employed to investigate the individual crucial component of the medium that significantly affected the enzyme yield. Results： Firstly, NaNO3, yeast extract, urea, Na2CO3, MgSO4, peptone and （NH4）2SO4 were screened as the significant factors positively affecting the xylanase production by PBD. Secondly, by valuating the nitrogen sources effect, urea was proved to be the most effective and economic nitrogen source for xylanase production and used for further optimization. Finally, the CCD and response surface methodology （RSM） were applied to determine the optimal concentration of each significant variable, which included urea, Na2CO3 and MgSO4. Subsequently a second-order polynomial was determined by multiple regression analysis. The optimum values of the critical components for maximum xylanase production were obtained as follows： x1 （urea）=0.163 （41.63 g/L）, x2 （Na2CO3）=-1.68 （2.64 g/L）, X3 （MgSO4）= 1.338 （10.68 g/L） and the predicted xylanase value was 14374.6 U/g dry substrate. Using the optimized condition, xylanase production by Aspergillus niger XY-1 after 48 h fermentation reached 14637 U/g dry substrate with wheat bran in the shake flask. Conclusion： By using PBD and CCD, we obtained the optimal composition for xylanase production by Aspergillus niger XY-1 in SSF, and the results of no additional expensive medium and shortened fermentation time for higher xylanase production show the potential for industrial utilization.     

紫外诱变黑曲霉微生物转化甘草皂苷

甘草皂苷是甘草的主要药效成分。但由于其结构上的特点,在机体中的运输和药效发挥上受到一定限制。微生物转化方法可以定向脱去一个单葡萄糖醛酸基以改变分子的极性,转化后的产物单葡萄糖醛酸基甘草皂苷元可以更好地为机体所利用。本文对微生物转化甘草皂苷所用黑曲霉进行了改性研究,通过紫外诱变使黑曲霉产生变异。从致死率曲线中选取黑曲霉变异几率最大的时间范围,再进行初筛、复筛和发酵,最后选出对甘草皂苷转化较高的变异菌株。实验筛选出的变异黑曲霉菌株对甘草皂苷的转化率为原始菌株的6.5倍。     

影响小麦饲粮酶制剂菌株产酶因子的研究

本试验对里氏木霉(Trichoderma reesei-xy07)和黑曲霉(Aspergillus niger-Y06)混菌固态发酵的培养条件进行优化,确定了菌株产酶最适的p H值、温度、含水量、碳源、氮源、铵盐及最佳发酵时间等,为小麦饲粮酶制剂生产和应用提供重要的理论基础.     

工程菌JM—109—pTrcHis2A—phyA表达植酸酶的研究

目的：将来源于黑曲霉的植酸酶基因重组于大肠杆菌表达载体pTrcHis2A中,导入大肠杆菌JM109中,构建工程菌JM－109－pTrcHis2A-phyA。方法：基因重组,以及克隆和外源基因诱导表达 技术。结果：该工程菌能够有效地表达真核植酸酶基因,并且添加诱导剂IPTG,能使植酸酶的表达量成倍提高。结论：该表达系统被用做研究黑曲霉植酸酶体外改良的工具。     

利用黑曲霉诱导法克隆高山红景天UGT3基因片段

利用真菌诱导法克隆高山红景天糖基转移酶（UDP-glucosyltransferase,UGTs）基因.结果表明：用浓度为40mgS/L黑曲霉诱导子处理愈伤组织4d和6d,糖基转移酶基因的mRNA丰度最高;克隆得到的基因cDNA片段长度为1366bp,与所选取的其他植物糖基转移酶一致性在50%以上,具有糖基转移酶家族典型的结构域.把该基因命名为UGT3,GenBank接受号为EU199079,为后续实验奠定基础.     

烟曲霉细胞壁作为药物靶标的鉴定研究

烟曲霉(Aspergillus fumigatus)作为侵袭性真菌感染的三大机会病原真菌之一,因其高致病率和高致死率而成为威胁人类健康的重大隐患。有限的抗真菌类药物以及近年来耐药性菌株的涌现使得寻找新的药物靶标并开发新型抗真菌药物迫在眉睫。真菌细胞壁作为真菌所特有的结构一直以来被认为是理想的药物靶标。本文概述了烟曲霉细胞壁结构及合成过程的相关研究进展,并分析了参与细胞壁各组分合成的酶作为药靶的可行性。     

黑曲霉变异株St-9308的选育

以黑曲霉为出发菌株、经硫酸二乙酯、亚硝基胍、紫外线多次诱变，使糖化酶的活力比原菌株提高，并对其产酶条件作了研究。     

黑曲霉中提取葡萄糖氧化酶的探索Ⅱ.用反向胶束法提取葡萄糖氧化酶

从黑曲霉菌种中，经多次筛选培育获得含有较高酶活力葡萄糖氧化酶的菌株，并进一步获得了胞内酶的浸出液．采用反向胶束法从浸出液中提取葡萄糖氧化酶，通过对温度、ｐＨ值、表面活性剂类型和浓度、有机溶剂、震荡时间、静止时间、离子强度、低级醇的加入和相比等条件的探索，研究了用反胶束提取葡萄糖氧化酶的方法，对反向胶束的形成及萃取的机理也作了适当的讨论     

固体中成药干,湿法灭菌效率比较

用湿热灭菌法和干热灭菌法测定新癀片半成品中5种污染霉菌孢子的热致死温时,结果表明短柄曲霉(Aspergillus brevipes)8 201菌株的耐热性最强。以湿热法和干热法灭菌的热致死温时分别为60℃/30min和80℃/100min,通过加热灭菌效果的统计学推算,建立新癀片的科学灭菌方法。