采用PCR技术检测植物病原菌

聚合酶联反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)用于各类DNA、RNA的体外扩增,具有灵敏、特异、快速等诸多优点,目前已广泛地作为人类、动植物病毒、真菌等分子检测的重要手段.并在此基础上与分子生物学其他最新技术相结合, 进一步发展了IC-PCR, real time fluorescent PCR, PCR-ELISA等复合PCR技术.将PCR技术与这些方法的突出优点相结合使用,从而提供了更快捷、特异、准确、高效检测侵染植物病原菌的方法.     

LPA法克隆嗜盐菌Halobacterium species xz515古紫质基因

Halobacterium species xz515是从中国西藏分离到的嗜盐菌，所含古紫质(古细菌视紫红质的简称命名为AR4)具有与其他已知菌视紫红质相反的质子释放和吸收的顺序而引起重视．连接反应介导的PCR扩增法(LPA)是一种克隆部分序列已知的基因的新型克隆方法．LPA法利用“酶切-连接-PCR”之组合，首先选定一组限制性内切酶，各自单独地酶切细菌总DNA样品，然后酶切产物分别与相应的寡聚核苷酸片段接头连接．连接液混合起来，作为扩增未知序列DNA的模板．通过这种方法，克隆到了包括完整AR4基因开放阅读框和0．4kb上游调控区域的总长度1．3kb的DNA片段．实验结果表明LPA法可以代替传统的构建基因组DNA文库的方法，可以快速有效地获得目标基因相关的序列．     

鹅常见病毒性疾病的快速诊断技术的建立及其应用

根据3种病原基因组相关基因的序列特征设计了三对PCR引物，用于鹅常见的病毒性疾病包括鹅副粘病毒病、鸭瘟、小鹅瘟的鉴别诊断．三对引物均能从各自的参考毒株扩增出与预计片段大小一致的产物，而对其它的病原的扩增结果均为阴性；应用建立的PCR方法对来自广西不同地方的38份临床可疑病例分别进行诊断，DPV、APMV-1和GPV的检测阳性率分别为66．6％(10／15)、55．6％(15／27)和75％(6／8)，二重及三重混合感染的占42．8％(9／21)．研究结果表明建立的PCR方法具有快速、敏感、特异的特点，可用于疫病的临床快速鉴别诊断特别是多重感染的诊断以及流行病学的调查研究．     

定量PCR法判定对虾白斑杆状病毒早期的感染和增殖

对虾白斑杆状病毒又称白斑综合症病毒,是对虾养殖业危害最严重的病原体,至今未找到有效的防治方法.充分了解病毒的分子生物学特性和分子致病机理,是病害防治的根本途径,了解病毒的动态增殖特征是该研究的基础.本文采用定量PCR技术,研究对虾白斑杆状病毒人工注射感染后,早期的增殖规律以及感染致死对虾的病毒累积.并对对虾感染病毒后存活时间与个体大小的关系进行了观察.研究发现初期感染病毒含量有短期下降,然后才呈现递增的过程.死亡对虾病毒累积量大于1011病毒粒子/毫克组织(P<0.01).而在4.6～11.6g范围内,感染对虾存活时间与对虾质量不存在相关性(P>0.2).     

SRY基因在部分动物类群系统进化中保守性研究

用特异于人 HMG- box区域的一对引物 ,对脊推动物 5个纲 10个物种及 2种无脊推动物的基因组 DNA进行 PCR扩增 ,并以 dig标记的人 SRY基因为探针 ,与扩增产物进行 Southern杂交 ,结果表明 :在这 12个物种中都存在 SRY基因的同源序列 ,无脊推动物克氏螯虾及背角无齿蚌杂交中显色较慢 ,表明 SRY基因在系统进化中具有高度的保守性且同源程度与物种在进化上的地位有关     

兜唇石斛的位点特异性PCR鉴别

根据兜唇石斛及其它37种枫斗类和黄草类石斛的rDNA ITS序列，设计了鉴别兜唇石斛的位点特异性PCR引物DC—JB01S和DC—JB01x，并对兜唇石斛成功地进行了位点特异性PCR鉴别．在进行位点特异性PCR鉴别之前，首先运用扩增ITS区的通用引物P1、P2对模板DNA进行扩增，以验证模板的可靠性和扩增的合适浓度．当退火温度上升为64℃，只有兜唇石斛的模板DNA能被扩增出来，而其它的37种石斛属植物均为阴性．该鉴别反应重复性好，已在鉴别我国兜唇石斛中发挥重要作用．与DNA测序鉴别方法相比，位点特异性PCR具有简单、省时、高效、准确等优点．     

甜菊钙调蛋白基因的克隆及结构分析

钙调蛋白（Calmodulin）是生物细胞内一种重要的调控蛋白，通过其与靶酶的相互作用控制细胞正常的生长发育及细胞对外界环境变化的反应，我们从甜菊顶芽和花芽中提取总RNA，逆转录合成cDNA第一链，以此为模板，参考GenBank上已发表植物的钙调蛋白基因序列合成5′端和3′端引物，利用多聚酶链式反应（PCR）扩增并克隆得到了甜菊钙调蛋白基因的两个异型基因，序列分析表明，它们均由450个核苷酸组成，编码148个氨基酸，在核苷酸序列上与迄今已知的多种植物钙调蛋白均有很高的同源性，同源率在83％以上，编码的氨基酸序列同源性更同，同源率高达95％以上，这两个基因之间存在差异，其核苷酸序列同源率为85％，编码区的氨基酸序列的同源率为99％，仅在第122个氨基酸由ALA代替了VAL。     

改进的PCR法克隆带小棒链霉菌cefD基因

以GC含量高达74％的带小棒链霉素（S．clavuligerus）染色体DNA为模板，从引物设计、退火温度、有机辅剂及DNA聚合酶等方面改善PCR反应体系和扩增条件，成功地克隆得到了异青霉素异构酶的cefD基因。改进后的PCR体系中ψDMSO＝0．05并加入适量的TaqDNA聚合酶，退火温度比常规选选择高一些，从而克服了常规PCR法扩增链霉菌基因遇到的二级结构复杂、引物与模板难以配对及引物间的引物内部易形成碱基配对等问题。改进后的PCR法提高了链霉菌基因克隆的效率，也可以广泛应用于高GC含量目的的基因的快速扩增。     

幽门螺杆菌检测方法的研究进展

幽门螺杆菌(Helicobacter Pylon,Hp)感染是引起慢性胃炎、消化性遗疡、胃癌的主要病因．阐述了传统的尿素酶试验、快速呼气试验及最近发展起来的Hp抗原和基因水平检到等多种检到Hp的方法。     

新型嵌合补体抑制分子HCI-3的设计构建及真核细胞表达的研究

目的：基于抑制补体活化的两个关键环节，即C3／C5转化酶及MAC的形成，设计、构建及制备一种新型、高效的补体抑制剂．方法：首先设计引物，通过PCR技术扩增重组可溶性CD46／CD55／CD59嵌合分子cDNA片段，重组于pcDNA3．1( )真核表达载体上，构建兼有三分子功能的CD46／CD55／CD59嵌合补体抑制分子，命名为HCI-3(Human Chimeric Complement Inhibitor,HCI-3)．分别利用COS-7细胞和CHO细胞进行表达，并用抗人CDl6多抗及抗人CD55，CD59单抗对表达产物进行Western Blotting鉴定．结果：DNA测序结果证实，前端带有CD59信号肽序列，后端融合有编码6个组氨酸碱基的HCl-3 cDNA片段的阅读框完整．免疫印迹结果显示，表达的重组蛋白分别能与抗人CD46多克隆抗体和抗人CD55，CD59单抗结合．结论：成功构建并在真核细胞内表达了重组可溶性HCl-3分子，为进一步研制和开发新一代多功能、多靶点补体抑制剂奠定了基础．