声门上喉癌特异染色体区和重要基因的发现

探讨声门上喉癌发生、发展的特异染色体区和重要基因. 应用比较基因组杂交（CGH）分析了18例喉声门上鳞状细胞癌（LSCC）癌组织和癌旁组织的差异.同时，自行设计cDNA芯片对3例喉声门上癌癌旁组织、癌组织和转移淋巴组织中基因表达的差异进行了研究和聚类分析. CGH结果表明在某些染色体区存在特异的扩增和缺失.聚类分析将用于芯片研究的基因分为3组，即A， B和C.同时还发现一些表达差异在5倍以上的特异基因与喉癌发生相关. 上述特异染色体区和重要基因的发现将为喉癌发生、发展和转移的研究提供重要线索.     

用cDNA阵列鉴定基因表达

采用ｃＤＮＡ文库单克隆ＤＮＡ点膜,与ｍＲＮＡ反转录标记的探针杂交,建立了一种可被广泛应用的系统鉴定基因差异表达的ｃＤＮＡ阵列方法。用此方法鉴定了拟南芥悬浮细胞系,苗及苗对紫外线辐射应答的基因表达模式,通过主要差异表达克隆的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交和序列测定分析证实了此方法的有效性和可靠性。     

对一个在水稻雄蕊中大量表达的cDNA的结构和表达分析

雄蕊的发育是植物有性生殖过程中的一个重要阶段、研究雄蕊发育过程中大量表达乃至特异表达的基因对于了解雄蕊发育的分子机制具有重要的意义。在水稻雄蕊中大量表达的一个类查尔酮合酶基因的结构进行了分析,发现Ｄ５与欧洲油菜中另外２个花药特异性基因的同源性较高,Ｎｏｒｔｈｅｒｎdisplay structure     

水稻中一种RNA结合蛋白cDNA的筛选和结构分析

植物叶绿体基因组全结构的阐明,已充分揭示该遗传体系兼有原核生物和真核生物基因组的特征。在叶绿体基因中,除存在一些内含子结构外,还具有像rpl12这样复杂的分割式基因。同时,不同基因的转录速度也存在着显著的差异。这些都意味着叶绿体基因在转录后必然有着复杂的剪接加工过程。RNA结合蛋白是一类在RNA加工中起重要作用的蛋白。Li等首次从烟草叶绿体中分离到与RNA转录直接相关的RNA结合蛋白,并且证明它们是由细胞核编码,在细胞质中合成后再输入到叶绿体中去的。至今,已从烟草、菠菜以及拟南芥菜等植物中发现了约10种核编码的叶绿体RNA结合蛋白,它们有类似的构造特征。我们从水稻cDNA文库中首次筛选到一个RNA结合蛋白(cp28)的基因,其相应的肽链由264个氨基酸组成。和其他叶绿体RNA结合蛋白相仿,它也包含有两个RNA结合结构域(称为consensus sequence-type RNA-binding domain,即CS-RBD),其中各含有一个由8个氨基酸组成的高度保守的一致顺序(ribonucleoprotein consensus sequence,即RNP-CS)。N端区域的传送肽(穿膜信号肽)由60个氨基酸组成,其后是一段负电荷十分集中的酸性肽段,但传送肽和酸性肽段的氨基酸顺序与其他植物的RNA结合蛋白的同源性很低。根据全长肽链的同源性比较,我们还分析了水稻cp28     

多聚酶链式反应应用于带入Ⅸ因子cDNA的转基因小鼠的初筛

在转基因小鼠的制备中,对于所导入外源DNA的检测一般采用DNA-DNA分子杂交法.由于它具有敏感性和可靠性高等优点,故它在转基因小鼠的研究中是不可少的.然而,这种方法在实际应用中也有一些缺点,如操作复杂、工作量大、实验周期长、DNA样品量大以及放射性同位素来源的时间限制等,这些都给转基因小鼠的制备带来了一定的困难.我们在人凝血IX因子(Clotting factor IX)转基因小鼠的制备中,将多聚酶链式反应(Polymerase chainreaction,PCR)技术应用于转基因小鼠的初筛,并与Southern杂交结果进行了比较.结果表明这种方法是可行的,其最大的优点是提高了效率,缩短了实验周期.     

人G-CSF突变体cDNA在大肠杆菌中的高效表达

人粒细胞生长因子(hG-CSF)应用前景非常广阔,它对于治疗各种原因引起的粒细胞减少症具有显著疗效.利用基因工程技术生产是大量获取有药用价值hG-CSF的一条重要途径.国外文献报道,由于自身结构特点,hG-CSF天然cDNA在大肠杆菌中很难获得高效表达,因此,构建其突变体,并在不同启动子控制下进行表达研究,以期实现其在大肠杆菌中的高效表达是hG-CSF基因工程研究的核心课题.     

视网膜神经节细胞诱向因子(RGNTF)分子克隆及其cDNA序列分析

1991年周明华等分离、鉴定的30kuRGNTF新蛋白,具有维持和促进视网膜神经节细胞存活、生长的效应;经原位杂交在初生大鼠的上丘浅、深部发现有RGNTFmRNA阳性神经元;继而制备了RGNTF的单抗和抗独特性单抗,观察RGNTF在大鼠胚胎、幼鼠及成体鼠的定位分布.为能进一步研究RGNTF的功能,正进行该因子的基因克隆研究.本实验取50只新生大鼠上丘脑组织(湿重1g),分离提纯mRNA,反转录合成cDNA,装上EcoRI接头再克隆到λgtll载     

丙肝病毒全基因组cDNA克隆侵染细胞培养体系的建立

以含有丙肝病毒全基因组cDNA的重组质粒(pHCV)为材料, 通过基因转染、重组痘病毒辅助使之在HeLa细胞中表达HCV病毒体, 建立了一种新的HCV体外细胞培养系统. 采用RT-PCR, 荧光定量RT-PCR, 链特异性RT-PCR, 免疫印迹, 免疫电子显微镜和电子显微镜负染技术跟踪检测HCV的增殖效率, 结果显示, 该培养体系中有HCV正链RNA的合成和HCV结构蛋白、非结构蛋白的表达, 并组装成直径约47 nm的HCV病毒体, 病毒体可被偶联有胶体金的抗HCV结构蛋白E2的单抗标记; 该体系产生的HCV病毒体滴度达107基因拷贝/mL, 远远高于病人血清中的HCV基因拷贝数, 也高于迄今报道的任何一种HCV细胞培养体系的病毒滴度. 检测结果证明, 转染细胞裂解上清中的HCV病毒体可以感染肝癌细胞系Huh7, 并在感染细胞中增殖和合成负链RNA中间体, 病毒滴度达106基因拷贝/mL.     

褐飞虱取食水稻幼苗cDNA文库的构建及筛选

以褐飞虱取食 3 2 h的水稻幼苗为材料构建了 c DNA文库 ,初始文库含 3 .2× 1 0 6 个克隆 ,重组率为 86%,取 1 .0× 1 0 6个克隆子扩增一次 ,收集到 80 m L滴度为 1 .2× 1 0 9pfu/ m L的扩增文库 .随机挑取 2 0个克隆以 T7和 M1 3 reverse为引物进行 PCR扩增 ,以鉴定插入片段的大小 ,结果发现多数片段的长度在 1～ 4.0Kb左右 ,少数片段在 4Kb以上 ,个别片段在 6Kb左右 .以在受褐飞虱取食的水稻幼苗中特异表达的 ESTBp Hi0 0 8为探针 ,筛选 c DNA文库 ,得到该基因的 c DNA全长     

Isolation and Characterization of Phytoene Desaturase cDNA from Stigma of Crocus sativus

Phytoene desatumse (PDS) has recently been identified as an important enzyme in carotenoid biosynthesis pathway. A cDNA clone encoding phytoene desaturase gene is isolated from stigma of saffron (Crocus sativus L. ) using RT-PCR technique. Sequence analysis shows 85% similarity to Narcissus pseudonarcissus, 79% to Zea mays, 78% to Arabidopsis thaliana, 77% to Lycopersicon esculentum. A new full-length cDNA is obtained by 5 ‘-RACE and 3‘ -RACE techniques. The cDNA is 2149bp long with an open reading frame of 1697bp, which encodes a polypeptide of 565 amino acids. Southern analy-sis shows that the PDS gene is a single copy in saffron. Northern blot analysis shows higher expression level of PDS gene in stigma and anther than in leaves and stem.