棉花纤维细胞分化相关基因的cDNA阵列分析

利用陆地棉(Gossypiumhirsutum)品种徐州142(野生型)开花前1-3d的胚珠构建了一个高质量的cDNA文库,从该cDNA文库中提取13056个质粒,用Biomek2000高密度点阵系统,将这些质粒点于强化硝酸纤维素膜上.分别用徐州142野生型和无絮突变体开花前1-3d的胚珠mRNA反转录标记探针与cDNA阵列杂交,筛选到8个在野生型胚珠中高表达的基因,其中4个在GenBank中有同源序列,4个为未知新基因.Northern杂交表明有两个基因在野生型中比突变体中表达量显著提高.     

粉尘螨Ⅰ、Ⅱ类抗原(Der f 1,Der f 2)的cDNA克隆测序

粉尘螨Der f 1、Der f 2 cDNA的克隆及测序分析.设计合成引物,常规抽提粉尘螨螨体总RNA,RT-PCR获得cDNA,经纯化回收后分别克隆至pMD-18T,转化大肠杆菌E.coli JM109,经PCR初筛挑选阳性克隆并测序.从粉尘螨基因组RNA中扩增出Der f 1、Der f 2 cDNA片段,分别测得其核苷酸序列.Der f 1 cDNA测序结果与GenBank提供的Der f 1基因(emb|X65196.1)去掉内含子后的序列经Blast分析,发现它们核苷酸同源性为99.52%,而Der f 2 cDNA序列与郝敏麒等报道的广州地区粉尘螨Der f 2的cDNA序列(AF346905)相比,未发现有插入序列.成功地对粉尘螨Der f 1、Der f 2 cDNA进行克隆测序,发现不同动物区系粉尘螨的Der f 1、Der f 2 cDNA序列存在差异.     

石斑鱼卵巢cDNA文库构建及脂肪酸结合蛋白克隆

应用SMARPTM技术构建了斜带石斑鱼Epinephelus coioides卵巢cDNA文库。所构建的cDNA文库滴度为4.5×106 pfu/mL,重组率为99％,扩增后文库的滴度为1.2×1010pfu/mL。把phagemid转化为质粒后,随机挑选60个阳性克隆进行酶切鉴定和测序。酶切结果表明:插入片段长度均在500~3 000 bp之间。测序结果经过生物信息学分析,发现其中一个克隆为脂肪酸结合蛋白(FABP)基因全长,并与人肝型(L)脂肪酸结合蛋白同源性最高,为70％。     

中华绒螯蟹卵巢新基因EJ05的全长cDNA克隆和序列分析

利用RACE技术从中华绒螯蟹卵巢获得了新基因EJO5（Eriocheir japonica ovary gene 5,EJO5)的全长rDNA序列(GenBank检索号：AY185921)．该cDNA序列长度为1425hp，开放阅读框为585bp，编码194个氨基酸．根据氨基酸序列计算的相对分子质量和等电点分别为22344和9．5．用生物信息学的方法未能得到对该基因功能预测的信息。     

青岛文昌鱼神经胚中期cDNA文库的构建

提取青岛文昌鱼18小时神经胚中期mRNA,以5＇脱磷的NotI-oligo(dT)18为引物,反转录合成cDNA.双链cDNA的5＇端钝端连接上带EcoRI突出末端的衔接头,再经NotI酶切,在cDNA的3＇端形成NotI突出末端.以SizeSep离心层析柱除去400bp以下的小分子,与带有NotI和EcoRI突出末端并经过5＇端脱磷的λExCellNotI/EcoRI/CIP载体DNA进行连接,经体外包装和感染NM522宿主菌,得到了3.6×10     

3种淡水鱼GSTR的cDNA克隆与肝脏组成型表达比较

比较不同生态习性淡水鱼类微囊藻毒素去毒能力与其肝脏Ⅱ相去毒酶Alpha-及Rho-谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-tmnsferase,GST)基因组成型表达之间的关系.采用RT-PCR及RACE方法成功克隆鲢鱼(Hy-pophthalmichthys molitrix)、尼罗罗非鱼(Oreochromis nilotica)、草鱼(Ctenophatyngodon idellu)肝脏Rho-GST(CSTR)基因cDNA全序列.应用半定量PCR方法以β-肌动蛋白为外参照,研究鲢鱼、尼罗罗非鱼、草鱼肝脏Alpha-GST(CSTA)及GSTR基因的组成型表达水平.结果表明,3种淡水鱼类微囊藻毒素去毒基因GSTR序列全长分别为1078 bp、904 bp、1104 bp.鲈形目鱼类的罗非鱼GSTR基因组成型表达相对较高,而鲤形目鱼类的鲢鱼、草鱼GSTA基因组成型表达相对较高.可见不同生态习性淡水鱼类GST基因组成型表达的高低可能与3种淡水鱼类生态习性及去毒能力有关,但对于不同生态习性淡水鱼类去毒能力的分子机制尚待进一步研究.     

中华绒鳌蟹卵巢发育相关的新基因EJO3的克隆和特征分析

运用了抑制性差减杂交和cDNA芯片技术鉴定中华绒鳌蟹卵巢发育相关基因,并用5'和3'RACE的方法克隆了一个与Ⅱ期相比在卵巢发育的Ⅲ期高表达的新基因EJO3(GenBank登录号:AY185919).EJO3基因的开放阅读框(ORF)长1 368 bp,编码455个氨基酸.从氨基酸序列推算的EJO3的等电点和相对分子质量分别为5.79和50 000.生物信息学分析表明,EJO3可能是一个含有VWD结构域的分泌蛋白.EJO3在Ⅱ期和Ⅲ期卵巢的差异表达用Northern blot进行了进一步验证.组织表达谱分析表明EJO3在卵巢高表达,在肠、心脏、肌肉和肝胰腺中弱表达或不表达.本研究结果为进一步深入研究中华绒鳌蟹卵巢发育的分子机制奠定了重要的前期工作基础.     

蝎α-毒素的分子进化:加速突变与功能趋异

蝎α-毒素为一类空间结构高度相似而药理学功能趋异的蛋白质家族.cDNA序列分析表明蝎α-毒素5′非翻译区和信号肽编码区序列的保守性显著高于成熟毒素编码区,3′非翻译区在药理学组内高度保守.而且,成熟毒素编码区密码子第1,2和3位核苷酸突变率相似.非翻译区内每个位点的核苷酸替代数(K)小于成熟毒素编码区内每个同义位点的核苷酸替代数(Ks),而且成熟毒素编码区内每个非同义位点的核苷酸替代数(Ka)接近或大于Ks值.上述数据表明,蝎α-毒素成熟肽编码区内的突变为加速进化方式.这一结论得到进化树结果的支持.此外,研究还表明稳定3D结构的15个保守性残基靠近分子内部,这可能作为蝎α-毒素结构性限制因素在进化过程中维持CSαβ结构的恒定;4个热点突变区分布于分子表面的潜在功能区,表明正性Darwin选择驱动了蝎α-毒素的加速进化.研究结果合理地解释了蝎α-毒素保守性3D结构与趋异的药理学功能之间的关系.     

斑鳜肌球蛋白轻链1基因cDNA的克隆及其分析

为提取斑鳜肌肉组织的总RNA,应用PCR法扩增肌球蛋白轻链1基因(MLC1).结果获得斑鳜MLC1(基因库登录序列号为:GQ282999),cDNA序列的全长为579 bp,编码192个氨基酸,理论相对分子质量为20 778.57,等电点为4.51,该序列具有2个EF-手相结构.氨基酸序列比对结果表明,第2个EF-手相...