甜菊钙调蛋白基因的克隆及结构分析

钙调蛋白（Calmodulin）是生物细胞内一种重要的调控蛋白，通过其与靶酶的相互作用控制细胞正常的生长发育及细胞对外界环境变化的反应，我们从甜菊顶芽和花芽中提取总RNA，逆转录合成cDNA第一链，以此为模板，参考GenBank上已发表植物的钙调蛋白基因序列合成5′端和3′端引物，利用多聚酶链式反应（PCR）扩增并克隆得到了甜菊钙调蛋白基因的两个异型基因，序列分析表明，它们均由450个核苷酸组成，编码148个氨基酸，在核苷酸序列上与迄今已知的多种植物钙调蛋白均有很高的同源性，同源率在83％以上，编码的氨基酸序列同源性更同，同源率高达95％以上，这两个基因之间存在差异，其核苷酸序列同源率为85％，编码区的氨基酸序列的同源率为99％，仅在第122个氨基酸由ALA代替了VAL。     

烟草拟核小体组装蛋白cDNA的克隆、表达及其蛋白产物的纯化

从烟草BY2细胞cDNA文库中筛选到核小体组装蛋白1(Nucleosome assembly protein1,NAP1)的cDNA，序列分析发现该NAPI的cDNA编码374个氨基酸，与巳知植物来源的NAP1同源蛋白相比具有80%，以上的同源性，而且一些具有重要功能的结构域是相当保守的，如核定位信号，核输出信号，酸性结构域及异戊烯化修饰位点，重要功能结构域的存在预示了NAP1蛋白潜在多种功能，为了深入研究MAP1的功能，应用大肠杆菌表达体系高效表达了烟草NAP1蛋白，并以表达产物进行了分离纯化。     

用酵母双杂交筛选与AP-2α相互作用的因子

AP—2α是重要的转录因子家族AP—2α的成员之一，为了研究AP—2α在体内的转录调控方式及与其直接相互作用的蛋白因子，用AP—2α作为饵蛋白通过酵母双杂交系统筛选HeLa细胞的cDNA库，筛选得到的一个阳性克隆中，经鉴定含有人TESTIN基因cDNA片段自5876bp起始的完整3′端序列，将此TESTIN片段引入GST基因融合系统成功的进行了表达，得到大小约45kD的GST—TESTIN融合蛋白，用于多克隆抗体的制备，用Western—blot检测TES—TIN和AP—2α在HeLa细胞中的表达和定位，结果表明：TESTIN的表达主要在细胞质中，细胞核内也有少量表达；而AP—2α表达主要集中于细胞核内，它们的相互作用可能与AP—2α在细胞内分布及其调控基因转录的方式有关。     

由标准强毒F114株全长cDNA克隆恢复猪瘟病毒

通过RT-PCR获得猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)强毒株cF114株(中国标准强毒F114株经PK-15细胞增殖)全长基因组cDNA并测序. 与已知其他几株CSFV代表毒株F114, Brescia, Alfort和C株的核苷酸同源性分别为99.41%, 96.80%, 86.03%和95.70%; 氨基酸同源性分别为99.28%, 98.54%, 93.33%和97.41%. 将获得的各基因片段按病毒基因组顺序连接成全长cDNA, 插入pMC18质粒SalⅠ/ XbaⅠ之间, 得到含病毒全长基因组的重组质粒pMC12297. 用T7 RNA聚合酶进行体外转录, 转录出的RNA转染PK-15细胞, 细胞上清液经扩增后, 测定上清液中病毒滴度. 质粒来源的CSFV(vM12297)在抗原反应性和复制能力方面与父代病毒相似. 将疫苗毒C株囊膜蛋白基因E01和E2分别替换到pMC12297相应位置, 获得嵌合体基因组质粒pM/CE01和pM/CE2, 体外恢复获得嵌合体病毒vM/CE01和vM/CE2. 两种嵌合体病毒均能感染PK-15, SK-6和原代猪睾丸细胞, 间接免疫荧光检测显示较vM12297弱, 在PK-15细胞上滴度达到8×10 F-PFU/mL. 这一工作为进一步研究和探讨CSFV增殖与致弱的机理提供了重要的实验和理论资料.     

中华绒螯蟹卵巢新基因EJ05的全长cDNA克隆和序列分析

利用RACE技术从中华绒螯蟹卵巢获得了新基因EJO5（Eriocheir japonica ovary gene 5,EJO5)的全长rDNA序列(GenBank检索号：AY185921)．该cDNA序列长度为1425hp，开放阅读框为585bp，编码194个氨基酸．根据氨基酸序列计算的相对分子质量和等电点分别为22344和9．5．用生物信息学的方法未能得到对该基因功能预测的信息。     

用扣除杂交法分离藏红花苷合成相关基因的克隆

对藏红花苷合成的相关基因进行了初步分离与克隆实验研究,旨在分离与藏红花苷合成相关的特异性表达的cDNA克隆,为进一步从分子水平上研究藏红花素的合成机理奠定基础。实验采用经添加诱导子和合成前体、处于藏红花苷合成状态下的藏红花细胞和未添加诱导子和合成前体、处于生长状态的对照藏红花细胞为材料,采用扣除杂交法成功地分离到6条与藏红花苷合成相关的特异性表达的cDNA克隆。结果表明:其中一条与胡杨中由高盐环境引起的差异表达的一条mRNA的序列有较高的同源性。     

粉尘螨Ⅰ、Ⅱ类抗原(Der f 1,Der f 2)的cDNA克隆测序

粉尘螨Der f 1、Der f 2 cDNA的克隆及测序分析.设计合成引物,常规抽提粉尘螨螨体总RNA,RT-PCR获得cDNA,经纯化回收后分别克隆至pMD-18T,转化大肠杆菌E.coli JM109,经PCR初筛挑选阳性克隆并测序.从粉尘螨基因组RNA中扩增出Der f 1、Der f 2 cDNA片段,分别测得其核苷酸序列.Der f 1 cDNA测序结果与GenBank提供的Der f 1基因(emb|X65196.1)去掉内含子后的序列经Blast分析,发现它们核苷酸同源性为99.52%,而Der f 2 cDNA序列与郝敏麒等报道的广州地区粉尘螨Der f 2的cDNA序列(AF346905)相比,未发现有插入序列.成功地对粉尘螨Der f 1、Der f 2 cDNA进行克隆测序,发现不同动物区系粉尘螨的Der f 1、Der f 2 cDNA序列存在差异.     

水稻幼叶及幼穗cDNA文库的构建及初步分析

为了克隆水稻第6染色体上S5位点的基因及包括广亲和基因在内的重要功能基因,以水稻Oryza sativa L.广亲和品种Cpslo17为材料,以λTriplex2TM为载体利用SMART技术构建了幼叶和幼穗2种器官的cDNA噬菌体文库.幼叶和幼穗原始文库的克隆数目为别为1.5×105 pfu和2.45×105 pfu,插入片段的大小均在500～3 000 bp之间,文库的阳性克隆子的为别比例为97.0%和98.7%.此文库的建立为克隆广亲和基因和其它重要全长功能基因奠定了基础.     

两株NIH-3T3细胞间的基因表达差异研究

通过与细胞膜表面的受体TNFRI结合．肿瘤坏死因子-α(TNF-α)可诱导凋亡或坏死．有两株NIH-3T3细胞在TNF刺激下分别存在两种死亡情况：NIH-3T3(R)为caspase依赖的凋亡；而NIH-3T3(S)的死亡则不依赖caspase．为了深入研究两株细胞在TNF-α诱导下选择不同死亡方式的机理，本研究利用cDNA表达谱芯片对这两株细胞的基因表达差异性进行研究，筛选出差异表达的基因，利用逆转录PCR验证，从而鉴定出两个可能与细胞死亡相关的基因：calpain6和RIP3．     

人肝癌组织IGF-Ⅱ cDNA变异体的克隆和顺序分析

人原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,研究其发生、发展的分子机理对于肝癌的诊断和治疗有着重要的意义,已有研究认为:癌的发生是多因素和多阶段的发展过程,其中癌基因的活动在癌变过程中起着关键的作用.在1988年,顾健人等已报道了有关肝癌的7种癌基因谱,IGF-II基因是其中之一.以后,顾健人等又报道了IGF-II及其受体(IGF-II R)在肝癌和癌旁组织同时过量表达,从而提示IGF-II及IGF-IIR可能有旁泌和自泌作用,它和肝癌