波纹唇鱼神经肽Y基因的克隆及原核表达

以波纹唇鱼为实验对象,采用同源基因克隆技术和RACE技术得到神经肽Y基因的cDNA全长序列.波纹唇鱼npy的cDNA全长序列为645 bp,包含59 bp的5'UTR、300 bp的ORF和286 bp的3'UTR.分子进化的比对分析表明,波纹唇鱼NPY前体与斜带石斑鱼和锯隆头鱼的亲缘关系最近.波纹唇鱼ORF编码99个氨基酸,NPY前体多肽包括:信号肽、成熟肽、Gly-Lys-Arg翻译后加工位点和羧基末端侧翼肽段(CPON).该NPY前体的预测分子质量为11.27 kD,理论等电点为5.51.采用pET-32a(+)原核表达系统构建波纹唇鱼npy基因的原核表达重组子pET-32a(+)-NPY,并获得重组菌株.对重组蛋白表达菌株进行培养条件优化,结果表明:该菌株在30℃,0.6 mmol/L IPTG,培养时间8 h的条件下,重组蛋白的表达效率最高.     

鲫血清转铁蛋白cDNA克隆及其序列分析

从GenBank数据库查询发表的鱼类转铁蛋白cDNA或基因序列,根据铁离子结合转运功能位点,设计并合成了两对引物P1、P4以及P2、P3,克隆出鲫血清转铁蛋白cDNA中的核心片段,长度为866 bp.再根据克隆出的核心片段分别设计上游及下游两对引物P5、P6以及P7、P8,随后用RACE方法分别克隆出鲫血清转铁蛋白cDNA的5'端(787 bp)和3'端(1 081 bp)以及全长cDNA,最后用计算机程序排列出鲫血清转铁蛋白全长cDNA,长度为2 444 bp.比较了12种鱼类血清转铁蛋白cDNA序列的同源性.     

扩展青霉碱性脂肪酶cDNA的克隆和表达

采用TRIzol试剂一步法所抽提的总RNA的D（260）／D（280）值为1.82,甲醛变性电泳呈现真核微生物所特有的28S rRNA和18S rRNA条带。根据扩展青霉所产碱性脂肪酶（Lip PE)N末端20个氨基酸残基序列和真核生物mRNA3‘端具有poly(A)等所提供的生物信息,采用RT－PCR技术和3‘－RACE法扩增了Lip PE成熟肽编码区和3‘非编码区的cDNA,直接将该PCR产物克隆至pUCm-T载体中。序列分析表明,该碱性脂肪酶含有258个氨基酸,其中保守的五肽序列为Gly-His-Ser-Leu-Gly。进一步采用Clot Tech公司的SMART^TM PCR cDNA文库构建试剂盒,扩增、克隆和测定了自转录起始点至编码区的cDNA片段,从而完成了Lip EP完整cDNA的分析测定。最后将编码完整脂肪酶蛋白的cDNA克隆至pGEX-5X-3表达载体中,在大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达,SDS－PAGE检测结果表明,所表达的GST－Lip EP融合蛋白分子质量约为53ku;免疫印迹（Western Blotting)技术证明了所克隆的cDNA确为编码扩展青霉WMC20718脂肪酶的基因。     

蕨晚期配子体发育相关cDNA的克隆和初步研究

利用差异显示PCR技术比较蕨早、晚期配子体(颈卵器期)在mRNA水平上基因表达的差异. 经Reverse-Northern杂交证实获得了6个和颈卵器发育相关的cDNA,对其克隆并测序. 用BLAST和DNAStar分析了各片段间的序列同源性,发现这些序列与水稻、拟南芥、大肠杆菌和人的一些序列具有同源性.     

人共刺激分子B7-1/CD80胞外编码区cDNA的克隆及序列分析

用RT－PCR法从人外周血单核细胞克隆了编码共刺激分子B7－1／CD80胞外区的cDNA，并用Snager链终止法进行测序，结果表明，所cDNA片段的序列与GenBank中已报道的人B7－1／CD80 cDNA序列的对应部分仅有两个碱基存在差异（658位A→T，773位A→G），这为探讨B7－1／CD80分子的生物学功能奠定了基础。     

小儿扁桃体淋巴细胞Poly（A）—RNA的制备及其cDNA的合成

采用盐酸胍法从经PHA诱导的小儿扁桃体淋巴细胞中提取总RNA,经Oligo(dT)-纤维素柱层析制备了Poly(A)-RNA。经蔗糖线性密度梯度超速离心步骤,富集了含IL-2mRNA的Poly(A)-RNA。经麦胚无细胞体系翻译实验表明,富集后的Poly(A)-RNA具有良好的模板翻译活性,其~3H-亮氨酸参入活性是对照的5.1倍。又以此富集了的Poly(A)-RNA为模板,按照Watson和Jackson的最新方法合成了小儿扁桃体淋巴细胞的双链cDNA。经碱性凝胶电泳检查,用此方法合成的cDNA长度最长的超过了IL-2的cDNA长度。     

卵转铁蛋白研究进展

我国是世界上最大的禽蛋生产和消费国,禽蛋中独特的功能性成分——卵转铁蛋白,因其丰富的保健功能而备受关注。本文根据近年卵转铁蛋白的研究现状,对蛋白的提取工艺、结构与转铁机理、生物学功能等方面等进行了综述,以便对卵转铁蛋白的进一步研究、推广及应用。     

利用Gateway技术构建天山雪莲cDNA表达文库

以天山雪莲为材料,利用gateway技术构建天山雪莲cDNA表达文库。从经低温处理后的天山雪莲叶片中提取并分离mRNA,合成双链cDNA;cDNA经BP重组反应重组到入门载体pDONR222上,构建得到天山雪莲en-try cDNA文库;天山雪莲entry cDNA再经LR重组反应将雪莲cDNA重组到植物表达载体pLEELA上,从而构建了天山雪莲cDNA表达文库。结果表明:cDNA入门文库滴度达到1.2×107cfu/mL,文库总容量为4.8×107cfu。表达文库的滴度为6.9×106cfu/mL,文库总容量为2.76×107cfu,插入片段平均大小1000 bp。阳性克隆率100%。天山雪莲cDNA表达文库的建立为进一步高通量筛选天山雪莲抗寒基因奠定了基础。     

大鼠4．5S snRNA的cDNA序列对荧光素酶基因表达的影响

利用脂质体转染法将大鼠4．5S snRNA cDNA重组载体转染小鼠肾离体培养细胞,连续培养48h,96h和144h检测荧光酶活性发现,4．5S snRNA cDNA插入表达载体的方向不同对荧光素酶基因表达的影响无差异,重组体转化的细胞中荧光素酶基因表达的活性与对照组相比提高2－2．2倍,4．5S snRNA cDNA对荧光素酶基因表达的影响,随转染细胞培养时间的延长而表达活性迅速下降,其下降速度实验组比对照组要快得多。     

牦牛转铁蛋白抗菌与抗肿瘤作用的实验研究

用细胞株体外培养技术和抑菌试验 ,研究牦牛血清转铁蛋白对HeLa细胞株生长的影响和对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌作用 .结果 :①一定浓度牦牛血清转铁蛋白对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌具有较强的抑菌作用 ,抑菌圈直径达 2 .0cm以上 ;②牦牛血清转铁蛋白在 10 μg/mL时 ,对HeLa细胞株生长和集落形成均无明显的抑制作用 ,但当牦牛血清转铁蛋白在 2 5 μg/mL时 ,对HeLa细胞株生长和集落形成均有明显的抑制作用 ,并且随着作用时间的延长和浓度的增加 ,其抑制作用明显增强 .这表明 ,牦牛血清转铁蛋白具有一定的抗菌和抗肿瘤作用