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11.
常规PCR与RACE结合法快速从cDNA文库中克隆基因 总被引:1,自引:0,他引:1
首先根据Fe(Ⅱ)-转运蛋白基因家族的保守区设计同源的常规PCR引物(F1,R1),扩增出490bp的特异片段。然后根据RACE法原理,巧妙地设计3′RACE(F2)和5′RACE(R3)特异性引物,使两者既能分别与文库载体上的筛选扩增引物配对扩增cDNA 3′和5′末端序列,又能使扩增出的3′RACE和5′RACE产物序列有重叠部分;另外设计引物时还兼顾到使F2和R3也能配对,从而能对3′RACE和5′RACE扩增产物进行双特异性引物常规PCR鉴定。该方案不但能够直接根据序列鉴定3′RACE和5′RACE产物是否为同一基因序列,还能快捷地用常规PCR鉴定3′RACE和5′RACE扩增产物是否为特异性扩增,避免了对非特异性扩增产物的克隆测序等繁琐的鉴定过程,优化了基因克隆策略。最后根据拼读出的全长序列设计引物(F4,R4)扩增出完整编码区。应用该方法成功地从小金海棠缺铁处理的根系cDNA文库中克隆了Fe(Ⅱ)-转运蛋白基因的cDNA。说明该方案是一种从cDNA文库中克隆目的基因的快捷优化方法。 相似文献
12.
利用分子克隆技术和生物信息学手段,克隆并命名了人spindlin 1 基因. 此基因cDNA全长4375?bp,含有236~949 bp完整开放读框,预测编码27?ku 的膜内蛋白. 新基因在核酸序列上与鼠spindlin基因有96%同源,其编码氨基酸序列与鼠spindlin蛋白98%同源. 生物信息学分析表明该基因定位于9q22.1-22.3 区域, 基因组DNA全长为52.3?kb,由5个外显子和4个内含子组成,内含子和外显子之间的剪切完全符合GT-AG法则. 利用绿色荧光蛋白与spindlin 1基因的融合蛋白表达载体转染COS-7细胞表明spindlin 1表达的蛋白定位于胞核,且转染后的细胞中较多见胞核形态的改变,例如出现双核或巨型核. 相似文献
13.
太空诱变宫颈癌细胞的差异表达基因初探 总被引:2,自引:1,他引:1
将搭载于“神舟四号”飞船飞行返地后的宫颈癌Caski细胞进行单克隆化,筛选出生长速度快于对照组、编号为44F10的细胞克隆,G1期细胞减少,S期细胞增多,成瘤能力增强;编号为48A9的细胞克隆细胞学行为与之相反,与对照组差异均有显著性(P<0.05)。为了解太空诱变肿瘤细胞生物学行为改变的机制,从分子水平入手研究经太空诱变的宫颈癌细胞和地面对照细胞的差异表达基因。应用含2747个人类肿瘤相关基因的Oligo双通道芯片研究差异表达基因。分别抽提44F10、48A9组和地面对照细胞的总RNA,逆转录cDNA并标记探针。将实验组和对照组cDNA探针混合,分别与同一张芯片杂交后,用不同的波长扫描荧光强度,从而筛选出差异基因。44F10组有16个基因呈现差异表达,48A9组有36个基因呈现差异表达。差异性表达主要涉及细胞凋亡、细胞增殖、细胞周期调控和信号转导的基因。促进细胞增殖的基因在44F10组中表达上调,而在48A9组中限制细胞增殖的基因表达上调。研究表明,太空诱变宫颈癌细胞的差异表达基因导致了细胞生物学行为的改变。 相似文献
14.
15.
应用阻抑性RACE方法克隆得到白鲫鱼的两个MT全长CDNA(MT-A和MT-B),它们可读框间的同源性为92.3%.用封闭式充氮层析系统得到高纯度的两个白鲫鱼肝MT蛋白,并用Edman法测定了N-端氨基酸序列.据此证明了MT-B是表达MT-2蛋白的基因,MT-A是表达MT-1蛋白的基因.此外测序过程中发现MT-1的N-端被封闭,而MT-2则是非封闭的,这提示它们在转录及翻译后调控机制的不同.白鲫鱼MT两基因的核酸序列和尾部非翻译区长度的差异(MT-A约150 hp, MT-B约360 bp),以及两 MT蛋白亚型的N-端封闭情况的不同,都为解释它们在组织中分布及其功能的差异性提供了线索. 相似文献
16.
蛋白质结构中某些氨基酸的氧化和还原是生物体内对蛋白功能的一种调控方式.甲硫氨酸(Met)被氧化则变为甲硫氨酸亚砜(Met(O)),它可导致所在蛋白质的生物学活性降低或丧失,但肽-甲硫氨酸亚砚还原酶(Peptide methionine sulfoxide reductase, msrA)则可使甲硫氨酸亚砜还原为甲硫氨酸,使其所在蛋白质重新恢复活性.为了研究人体中Met氧化还原的机制,以牛msrA cDNA序列为信息探针,筛选人EST数据库,依据若干同源EST的信息从人cDNA分子库中克隆到一个长1255hp的人MSRA cDNA.该CDNA包含一个长705 bp的可读框,它编码了 235个氨基酸残基.同源性比较表明,该基因与牛和大肠杆菌的msrA基因的氨基酸一致性分别为88%和61%.表达谱分析发现,该基因在人体大多数组织中均有一条长约1.6kb的转录本,并在肾中呈高表达.应用辐射杂种细胞株定位系统(radiation hybrid mapping panel, RH mapping)将该基因精确定位在人染色体8p22~23区带的DSS518和D85550位标之间,由于此前已有Keratolyticwintereryth 相似文献
17.
小麦苗期盐胁迫72h cDNA文库的构建及质量检测 总被引:2,自引:0,他引:2
以98-160盐胁迫72 h叶片的mRNA为起始材料,采用SMART技术构建了一个高质量的cDNA文库,经检测,未扩增文库的滴度为3.44 ×106 pfu/mL,白斑率>85%,插入片段多数在0.5~1.5kb,有的可以达到2kb,平均长度为800bp.因此,按照此方法构建的是1个高质量的cDNA文库,可有效地用于下一步全长基因的筛选和克隆. 相似文献
18.
19.
20.
以赤霉素 (GA)处理后的G2豌豆为材料 ,构建了一个 2 .0× 1 0 6的cDNA文库 ,用随机筛选法从该文库中得到一个 1 6 6 7bp的cDNA ,其 5′端非编码区长 1 0 0bp ,3′端非编码区长 2 2 3bp ,拥有一个 1 34 4bp的开放读码框 ,共编码 447个氨基酸 .DNA及报道的蛋白质序列同源性分析表明 ,它编码了豌豆延伸因子 1α(elongationfactor 1 alpha ,EF 1α) ,其功能区段具有很高的保守性 ,可应用于分子进化研究 相似文献