新基因Splt137在大肠杆菌中的表达及抗体制备

用PCR的方法扩增得到斜纹夜蛾核多角体病毒 (SpltMNPV)ORF137全长基因 (Splt137)。将其克隆到原核表达载体pQE30上 ,并转化大肠杆菌M15 ,在IPTG诱导下表达了与预期相对分子质量相符的一个 2 7× 10 7的蛋白质 ,经过聚丙烯酰氨凝胶电泳纯化 ,免疫家兔制备了抗Splt137抗体。Western免疫印迹分析表明 ,该抗体适合用作Splt137蛋白的进一步分析。     

胶原Ⅳα1链NC1结构域基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

 胶原中多个成分如ⅩⅤ,ⅩⅤⅢ的NC结构域能抑制血管内皮细胞增殖和迁移,具有抑制肿瘤生长和转移的活性.从胎盘组织中提取总RNA,根据文献报道的胶原Ⅳα₁链cDNA序列,设计一对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增出胶原Ⅳα₁链NC1结构域基因.DNA序列测定发现,扩增得到的基因与文献报道序列存在单个核苷酸变异(A132C),编码氨基酸(Gly)不变.将扩增得到的胶原Ⅳα₁链NC1结构域基因克隆到原核表达载体pPROEXHTb上,并在大肠杆菌BL21中进行体外表达.     

人表皮生长因子(hEGF)基因的合成、鉴定及植物表达质粒的构建

用PCR方法合成了人表皮生长因子（hEGF）基因，构建了原核表达质粒p 20T-hEGF，研究了原核表达的重组蛋白hEGF的生物学活性，并构建了植物表达质粒，研究表明：无论是融合蛋白GST－hEGF或纯化的hEGF蛋白，都有相当高的生物活性，hEGF蛋白对Hela细胞的增殖有很好的促进作用，免疫小鼠亦能产生很高的免疫应答反应。     

NaCl诱导表达的盐藻果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因克隆及原核表达

通过RACE技术克隆到盐藻（Dunaliella salina Teod.)果糖－1，6－二磷酸醛缩酶（DsALDP)的全长cDNA,对其序列分析及在GeneBank中进行同源搜索，发现DsALDP基因属于果糖－1，6－二磷酸醛酶基因家族，其与植物叶绿体果糖－1，6－二磷酸酯缩酶（AldP)基因的一致性为73％－66％。Northern杂交结果及醛缩酶活性分析均表明它角为在盐诱导下特异表达。将DsALDP cDNA构建到pET32a载体上，转入E.coli BL21进行表达分析。IPTG诱导后可以检测到－62ku基因产物大量表达。经不同浓度NaCl处理，表达DsALDP基因产物的细菌耐盐性明显高于对照组。     

bFGF真核表达载体构建及表达

旨在构建可在哺乳细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子（basic Fibroblast Growth Factor,简称bFGF）的真核表达载体，以便用于研究bFGF基因治疗在骨组织工程中的应用，应用基因重组技术，将已经克隆的bFGF基因从PBR322－bFGF载体上亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1上，构建的重组质粒经脂质体介导转染3T3细胞，36h后观察瞬时表达情况，酶切，PCR和DNA测序结果均证实了插入片段的正确性，免疫组织化学检测bFGF的表达分泌情况，结果显示部分经转染的细胞呈阳性（棕色颗粒）。结果表明已成功构建了bFGF真核表达载体pcDNA3.1-bFGF，并且bFGF能够在3T3细胞表达。     

条件性味觉厌恶学习对大鼠脑区亮脑啡肽表达的影响

比较观察了建立条件性味觉厌恶学习前后，成年SD大鼠脑丘脑内内源性亮脑啡肽的表达水平。发现条件性味觉厌恶学习组大鼠丘脑外侧背核、丘脑内侧背核外侧部以及丘脑腹后内侧核内亮脑啡肽免疫阳性神经元数目显著少于对照组。揭示脑内一些核团亮脑啡肽表达在条件性味觉厌恶学习过程中发挥作用。     

大肠杆菌caiE基因的克隆与高效表达

用聚合酶链反应（PCR）从大肠杆菌K12s中扩增大肠杆菌肉碱代谢相关酶基因cai E,将其克隆到克隆载体pBluescripy SK中，测序表明：该基因有612bp，与文献报道相比，有10个核苷酸不同，相应的翻译氨基酸有6个相异，将该基因重组到ColE1为复制子，T7为启动子控制下的分泌型表达载体pET-22b( )中，构建表达质粒pETCaiE，重组到载体pACYC184中构建以p15A为复制子，Lac为启动子的表达质粒pACYC-CaiE；重组到载体pWSK129中，构建以pSC101为复制子，T7为启动子的表达质粒pSC-CaiE。上述表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），经1mmol/L异丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）诱导后，均可表达，SDS－PAGE分析表明表达蛋白分子质量约26ku，表达量占菌体总蛋白质的比例分别为pETCaiE30%,pACYC-CaiE8%,pSC-CaiE5%。     

外源乳酸脱氢酶基在在双歧杆菌中的表达

以大肠杆菌-双叉双歧杆菌的穿梭质粒PhJ为基础，插入从Lactococcus lactis总DNA中用PCR方法扩增得到的报告基因乳酸脱氢酶基因（ldh)，构建了双叉歧杆菌的表达质粒phj-ldh，并采用电转化法导入双叉双歧杆菌进行了表达研究，对双叉双歧杆菌总蛋白的SDS-PAGE分析结果表明，ldh报告基因的表达产物形成了明显的条带，Western-boltting结果确认了该条带为ldh基因的产物，LDH的酶活性定量测定结果表明，重组双叉双歧杆菌的蛋白粗抽提液中LDH的比活性为5.5U/mg，菌中LDH的表达量约为2mg/L，此工作为今后双叉双歧杆菌的基因工程奠定了基础。     

异亮氨酸拉链结构对可溶性CD40L生物学活性的影响

CD40配基(CD40L)为TNF超家族中的一员，瞬时表达于激活的CD4^ 的T淋巴细胞上．自然状态下膜上三聚体的CD40L通过和CD40受体(CD40R)结合，在免疫监视和肿瘤免疫中发挥作用．以PCR方法从peDNA3-CD40L质粒上扩增得到编码CD40L基因的胞外部分sCD40L，并将该片段插入大肠杆菌表达质粒pET30a上，构建得到大肠杆菌表达质粒pET30a-sCD40L；同时，在sCD40L的N端融合了异亮氨酸拉链(Isoleucine Zipper，IZ)结构，构建得到表达质粒pET30a-IZ-sCD40L．表达质粒在大肠杆菌中表达，得到可溶性的重组人CD40L和IZ-CD40L．SDS-PAGE分析结果表明重组人rhsCD40L和IZ-rhsCD40L在相应分子质量位置都有明显的条带产生，并得到Western blotting的确认．非SDS-PAGE电泳结果显示，异亮氨酸拉链结构有利于rhsCD40L蛋白形成聚合体结构．B细胞增殖实验和人骨髓瘤细胞株XG2凋亡实验结果都表明，异亮氨酸拉链结构提高了rhsCD40L的生物学活性．     

hTERT主要HLA-A2.1相关基因的表达

为了研究hTERT的表达特性及意义。根据hTERT基因中与HLA-A2.1分子相关性较强的几个9mer肽段合成引物，通过RT-PCR技术分别对14例RCC组织和2例肿瘤细胞株进行了扩增，扩增片段大小为306bp(小片段）和1002bp(大片段），结果有13例癌肿组织表达hTERT基因小片段，1例组织不表达hTERT基因；Hela细胞和786-0肾腺癌细胞株均表达hTERT；对大片段进行克隆，酵母表达，构建了pPICZαA-hTERT重组表达载体和Pichia pastorisX33/hTERT酵母工程菌；SDS-PAGE电泳显示毕赤酵母能分泌表达39kD的目标蛋白。得出，大部分RCC肿瘤组织和细胞表达hTERTmRNA，而正常组织则不表达，提示hTERT可作为通用的抗肿瘤治疗尤其是免疫治疗的靶点。