环腺苷酸应答元件结合蛋白(CREB)参与人hsp90β基因的热诱导表达

为研究cAMP应答元件（CRE）在人热休克蛋白hsp90β基因表达中的作用,构建了数个受hsp90β基因不同长度调控片段介导的氯毒素乙酰基转移酶（CAT）报告基因质粒。分别转染Jurkat细胞并检测42℃1h热诱导前后CAT活性。结果发现删除hsp90β基因上游含CRE片段（－173／－91bp)后,CAT的热诱导表达活性降低了67％。电泳迁移率变更分析（EMSA）显示热休克后Jurkat细胞的核抽提物中磷酸化的CREB与该片段呈特异性结合。Western印迹实验及PKA活性检测发现CREB的磷酸化程度及PKA活性均随热诱导时间的延长而增加。以上结果表明：磷酸化的CREB通过与hsp90β基因上游的CRE结合参与该基因的热诱导表达,并可能与PKA传导途径有关。     

端粒酶高表达对Bcl-2的负调节使用

端粒酶和Bcl-2均对调控细胞凋亡有重要作用,端粒酶的活化及Bcl-2的表达失调还与肿瘤的形成密切相关。端粒酶与Bcl-2之间的确切联系目前仍不清楚。研究活化的端粒酶对Bcl-2表达的影响,首先发现在端粒酶阳性的肿瘤细胞或转化细胞中,Bcl-2的表达明显低于端粒酶阴性或活性低的细胞。进而,在外源性端粒酶催化亚基基因转化的成纤维细胞中,重新表达端粒酶的同时,Bcl-2的表达受到明显的抑制。进一步提示,端粒酶表达与Bcl-2的表达存在某种内在联系,前者的高表达可能对Bcl-2的表达起负调节作用。     

NF-L和NF-M在上皮细胞内表达并与角蛋白或波形纤维蛋白共组装

神经丝及细胞质角蛋白纤维都是异源多聚体,它们只有在与其他合适的中间丝蛋白亚基一起表达时才能装配成中间丝。为了研究不同类型的中间丝蛋白间的组装特性,构建了绿色荧光蛋白（GFP）与NF－L或NF－M融合蛋白的重组腺病毒表达载体,并将目的基因在vero细胞内表达,免疫荧光观察结果显示NF－L－GFP或GFP－NF－M不但能与细胞内源性波形纤维蛋白共组装,而且同样能掺入到角蛋白纤维网络中。     

围植入期大鼠子宫中血管内皮生长因子的表达与血管生成

大鼠胚胎植入过程中第1个明显的标志是植入部位血管通透性增高,且有明显的血管生成,但目前尚不清楚血管通透性增高和血管生成的发生机制。血管内皮生长因子（VEGF）是胚胎发生和成功动物血管生成的关键调节因子,也是血管通透性因子。用原位杂交和免疫荧光－共聚集激光扫描等技术研究了动情周期、去卵巢和围植入期大鼠子宫中VEGF的表达和血管的变化,以探讨它的可能调控机制及对植入的作用。结果表明,VEGF mRNA受卵巢甾体激素的调节;VEGF mRNA在植入前期主要定位于子宫腔上皮,植入启动时间向基质转移,植入后VEGF mRNA阳性信号广泛分布在蜕膜区域,VEGF蛋白的表达与其mRNA的表达基本一致。利用植物凝集素BS－1识别内皮细胞,用抗vWF的抗体识别血管,发现植入过程血管内皮细胞增殖活跃,血管更加丰富。结果提示VEGF在卵巢甾体激素的调控下,参与大鼠植入过程子宫内膜血管生成和血管通透性的增加,从而有利于胚胎的成功植入。     

人HGLP cDNA的克隆和原核表达

克隆了人HGLP cDNA,编码蛋白具有G蛋白偶联受体类似的7个跨膜区,具有视紫红质样G蛋白偶联受体超家族的基序（motif).Northern杂交分析发现HGLP广泛表达。将HGLP的N,C端非跨膜区片段克隆到pET30a^ 表达载体中,在E.coli中获得了高效表达。     

非结构蛋白NS1-ELISA检测禽流感野毒感染抗体

利用RT-PCR技术扩增获得了H5N2亚型禽流感病毒的NS1基因,ORF长度为678 bp。成功构建了重组表达载体pET-NS1,将其转化BL21(DE3),用终浓度1 mmol／I的IPTG诱导表达5 h,经15％的SDS-PAGE分析表明,诱导表达出了分子量大约为28 KD的 NS1融合蛋白,且以包涵体的形式存在,NS1融合蛋白经His trap Hp Kit柱子纯化或用尿素变性复性,获得纯度较高的NS1蛋白,并以此为抗原,建立了检测抗NS1蛋白抗体的ELISA(NS1-ELISA)方法。最佳包被浓度为2．5μg／ml,血清的最佳稀释倍数为1:200, 酶标二抗的最佳工作稀释度为1:5 000。重组NS1蛋白只与AIV感染的血清反应,而不与ND、IB、IBD、EDS76的阳性血清反应。分别检测H9N2、H5N2和H5N1亚型灭活疫苗和H9N2纯化病毒免疫的血清,各5份,其平均OD490值分别为0．225、0．210、0．205和0．184．均为阴性;而对H9N2和H5N2亚型活毒感染10-15 d的血清进行检测,各5份,其平均OD490值分别为0．610和0．619,均为阳性。因此,NS1蛋白能特异地区分野毒感染和灭活疫苗免疫鸡群,可作为一种鉴别诊断标记,但不能区分亚型．具有A型特异性。NS1-ELISA 方法的初步应用,不仅为生产提供了一种快速、特异、敏感的鉴别诊断方法,为进一步组装成试剂盒奠定了基础,也为禽流感的早期诊断、适时监控和净化提供了行之有效的方法。     

小鼠脂多糖应答蛋白mlrpS的载体构建及融合蛋白表达

为构建小鼠mlrpS-cDNA基因原核、真核表达载体,大肠杆菌表达其融合蛋白。采用反转录-聚合酶链反应从经脂多糖刺激的鼠NIH3T3细胞cDNA中,扩增出编码mlrpS的cDNA。用限制性内切酶KpnⅠand XhoⅠ消化后,插入原核表达载体pTAT中,经酶切鉴定与测序证实后,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株。异丙基β—D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导产生融合蛋白。经KpnⅠ和XhoⅠ酶切回收mlrpS-cDNA,插入pcDNA3．1载体中;pcDNA3．1-mlrpS再经KpnⅠ和ApaⅠ酶切后,插入到pEGFP—c1载体上,构建pEGFP-mlrpS融合的真核表达载体。构建mlrpS表达载体经测序证实,与GenBank登录的序列完全一致;双酶切鉴定证实,克隆基因正确插入载体pEGFP及pTAT;SDS—PAGE证实融合蛋白表达成功。说明：成功地构建了mlrpS原核、真核表达载体,成功正确表达了6His／mlrpS融合蛋白。     

重组果蝇Merlin蛋白的表达与纯化

NF2基因的的缺失会导致Ⅱ型多发性神经纤维瘤的发生.NF2又称Merlin,和ERM蛋白家族成员类似,Merlin蛋白N端的FERM结构域与C端的CTD结构域存在分子内的相互作用,从而形成一种自抑制的闭合构象;当Merlin蛋白N、C端分子内的相互作用被破坏时,能释放出N端的FERM结构域,从而能与许多效应因子相互作用...     

头颈部鳞状细胞癌差异表达基因分析

头颈部鳞状细胞癌是最常见的恶性肿瘤之一,病死率很高。本文从美国癌症基因组图谱(TCGA)数据库中下载头颈鳞癌的基因表达数据和临床数据,筛选HPV阳性和HPV阴性的头颈鳞癌组织之间与患者生存相关的差异表达基因,然后参考COSMIC和TSGene2.0数据库中的原癌基因和抑癌基因信息,挑选出可能使HPV阳性头颈鳞癌患者的预后优于HPV阴性头颈鳞癌患者的预后的基因。根据生存分析找到MAP4K1、IKZF3、MZB1、TSPAN32、CCND1、CDK6和WT1与HPV相关的头颈鳞癌的预后相关,为头颈鳞癌的临床诊断和治疗提供潜在的靶点。     

虎鲸DHX36解旋酶表达纯化及酶学特性分析

通过生物化学、生物信息学、生物物理学等方法系统地对虎鲸(Orcinus orca)DHX36解旋酶的酶学特性进行了分析。借助原核表达系统,表达纯化得到纯度大于95%的OrcDHX36蛋白。利用荧光各向异性法对OrcDHX36的底物结合活性进行研究,结果表明OrcDHX36可以特异性识别并结合G4 DNA结构,但无法与ssDNA,dsDNA结合。通过停流光谱技术探索OrcDHX36解旋酶学特性,确定了其体外解旋的最适条件,明确了OrcDHX36的解旋方向为3′-5′。通过对比蛋白质信息数据库NCBI已公布的DHX36氨基酸序列,明确了大量DHX36蛋白(包括OrcDHX36在内)均无识别G4结构的RSM区;采用邻位法构建进化树,展示了OrcDHX36以及其他物种DHX36之间的亲缘关系。选择与OrcDHX36亲缘关系较远,且同样不具备RSM区的鸽子DHX36(ClDHX36),研究两者解旋活力特征,为揭示无RSM区的DHX36蛋白的G4解旋机制提供参考。