人源程序性死亡配体PD-L2蛋白的原核表达与抗血清制备

利用原核表达系统获得包涵体表达形式的重组蛋白h PD-L220~123(Ig V结构域)和h PD-L220~208(Ig V结构域和Ig C结构域);将重组蛋白利用Ni-NTA柱亲和层析纯化与复性后,作为免疫原免疫Balb/c雌性小鼠制备鼠抗人的多抗血清,经ELISA法检测其效价均达到1∶106;Western-blot实验结果表明,制备的多抗血清均能特异性识别h PD-L2蛋白.以制备的多抗血清进行IHC实验评估与鉴定,结果显示:以h PD-L220~123重组蛋白为免疫原制备的多抗血清阳性较弱且定位模糊,以h PD-L220~208重组蛋白为免疫原制备的多抗血清具有很强的膜定位且背景清晰.     

LC3真核表达载体构建及其在293T细胞中自噬诱导研究

【目的】构建pEGFP-N1-LC3真核表达载体,并将其转染进人胚肾细胞293T,通过Earle's盐平衡液(Balanced salt solution,EBSS)饥饿诱导观察细胞自噬现象。【方法】RT-PCR扩增LC3基因,并将其插入pEGFP-N1真核表达载体构建重组质粒。将重组质粒转染至人胚肾细胞293T,显微镜观察、Western blot检测GFP-LC3融合蛋白表达情况。对转染细胞进行Earle's盐平衡液饥饿诱导,通过Western blot验证自噬指标,激光共聚焦显微镜观察自噬泡形成。【结果】成功构建pEGFP-N1-LC3真核表达载体,并在293T细胞中成功表达目的蛋白,在进行Earle's盐平衡液饥饿诱导后观察到自噬泡的形成,Western blot检测到LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化。【结论】本实验为研究自噬在癌细胞病理进程中的机制提供了实验素材。     

膜乳化-复乳化法制备载蛋白高分子微球

选择乙基纤维素（EC）为微球材料,牛血红蛋白（Hb）为模型药物,采用膜乳化-复乳（W1／O／W2）法制备了载蛋白高分子微球。采用扫描电子显微镜（SEM）考察微球形态及内部结构．激光粒度仪测定微球粒径及粒径分布。结果表明,膜孔径是决定微球粒径的主要因素．微球粒径随EC浓度和初乳相体积分数增大而增大。随着初乳相体积分数的增大,微球表面微孔数目减少,但孔径增大。当操作压力稍大于膜乳化初始临界压力时,可制得粒径单分散的栽蛋白高分子微球。这一结果对制备粒径单分散的栽蛋白高分子微球具有一定的参考价值。     

pH和盐浓度对火龙果种子分离蛋白功能特性的影响

以火龙果(Hylocereus polyrhizus)种子为材料,脱脂后分析其成分。采用Osborne分级分离法得到三种火龙果种子分离蛋白,检测其表面疏水性、巯基含量、热变性温度、氨基酸成分等理化性质,分析pH和NaCl浓度对火龙果种子分离蛋白的溶解性、持水性、发泡性、泡沫稳定性、乳化性、乳液稳定性等功能特性的影响。结果表明,火龙果种子脱脂粉中含量最高的三种成分为粗蛋白(51.04%)、粗纤维(23.60%)和总多酚(15.26%);火龙果种子中分离得到白蛋白、球蛋白和谷蛋白,提取率分别为19.51%、14.07%和32.29%;白蛋白由2个亚基组成(分子量23.4kD和14.2kD),球蛋白由3个亚基组成(分子量分别为21.7kD、18.7kD和15.2kD),谷蛋白由3个亚基组成(分子量分别为49.5kD、34.2kD和18.6kD);白蛋白、球蛋白、谷蛋白热变性温度分别为59℃、58℃和91℃;谷蛋白的表面疏水性(2730)最高;白蛋白的总巯基(5.38 mmol/L)和游巯基(2.35 mmol/L)含量最高;3种分离蛋白中谷氨酸和精氨酸含量较高。4≦pH≦6范围内3种蛋白的溶...     

重症呼吸衰竭患者血清NT-proBNP、HMGB1、IL-17水平与心肌损伤的相关性

目的 探讨重症呼吸衰竭患者联合血清N-端脑钠肽前体(NT-proBNP)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、白介素-17(IL-17)水平与心肌损伤的相关性.方法 收集85例呼吸衰竭患者的临床资料,应用电化学发光法检测血清NT-proBNP水平,酶联免疫吸附法检测血清HMGB1水平,放射免疫分析法检测血清IL-17水平...     

水杨酸对烟草GRPs基因表达的影响

通过RT-PCR得到富含甘氨酸RNA结合蛋白（GRPs）基因片段,利用northern杂交技术对水杨酸诱导不同时间不同烟草GRPs基因的表达模式进行研究.结果表明：水杨酸能诱导烟草GRPs基因上调表达,3 h达到最高,然后开始下降;但3个TMV抗性不同的供试烟草增加幅度不同,基因表达幅度与抗性有一定关系,抗性强的红花大金元表达增幅大于抗性较弱的云烟85.本研究明确了水杨酸诱导下烟草该基因的表达谱,揭示了SA诱导烟草不同抗性的品种的幅度不同,并且发现诱导后3 h为关键点,表明GRPs基因可作为烟草水杨酸代谢途径中的一个标记基因研究其途径对逆境的应答.     

凝胶阻滞试验分析铜绿假单胞茵LexA蛋白与其靶位点的特异性结合

目的:分析铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginoso,,PA)的LesA与其靶位点的特异性结合的特性.方法:以PCR法扩增PA的LexA基因,将其克隆于原核表达载体pET-22b( ),转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,采用镍离子亲合柱层析和Superdex-75凝胶过滤层析分离和纯化目的蛋白,以含推定LexA结合位点的片段CTGTN27ACAG为探针,用凝胶阻滞试验检测LexA蛋白与探针序列结合的能力及特异性.结果:构建了pET22b-LexA重组质粒,IPTG诱导目的蛋白表达率约为25%,获得纯度大于95%的目的蛋白;CTGTN27ACAG能与LexA蛋白发生特异性结合.结论:推定Lex4结合位点CTGTN27ACAG能与PA的LexA蛋白特异性结合,可能是LexA蛋白的结合靶位点.     

棉花黄萎病拮抗内生菌的筛选鉴定及抗菌物质研究

从棉株中分离筛选到一株对棉花黄萎病菌具有较强拮抗作用的内生细菌BSD-2.通过形态特征、生理生化特性以及16S rDNA碱基序列测定和同源性分析,鉴定其为枯草芽孢杆菌.平板对峙试验表明,BSD-2对多种植物病原真菌有抑制作用.BSD-2培养液以50 %硫酸铵沉淀所得的拮抗物粗提液,具有良好的热稳定性和酸碱稳定性,对胰蛋白酶、蛋白酶K和胃蛋白酶均不敏感,对氯仿敏感,能够有效抑制黄萎病菌孢子萌发.     

巴西固氮螺菌GlnB与NifA蛋白N端结构域的相互作用

巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)可与多种重要作物联合固氮, 具有作为生物肥料的潜能. 固氮基因(nif)的转录激活蛋白NifA和PⅡ信号转导蛋白家族成员GlnB是参与该菌固氮调控的两个关键蛋白, 且NifA的活性调控依赖于GlnB. 研究结果表明, 在无氮条件下GlnB与NifA蛋白N端结构域存在相互作用, 且N端18和53位酪氨酸突变为苯丙氨酸的NifA与GlnB的互作增强. 研究还发现, NifA蛋白N端66~88位和165~176位氨基酸区域对于与GlnB蛋白的相互作用是必需的.     

AtGRIP蛋白在拟南芥根冠细胞高尔基体反面网络分泌囊泡的定位

动物与真菌细胞的GRIP蛋白定位于高尔基体反面网络, 并对高尔基体的结构与功能有重要作用. 通过RT-PCR方法从拟南芥植株RNA中扩增得到AtGRIP的cDNA; 利用原核表达和亲和层析的方法, 获得AtGRIP部分片段的GST融合蛋白, 进而得到相应蛋白的多克隆抗体. 利用纯化的AtGRIP抗体进行免疫印迹, 确认拟南芥AtGRIP蛋白的分子量为92 kD, 并发现其在拟南芥根、茎、叶和花中均有表达; 免疫荧光标记AtGRIP和Nag-GFP的共定位说明, AtGRIP蛋白分布于拟南芥细胞高尔基体; 免疫金标结合电子显微镜观察发现, AtGRIP蛋白主要定位于拟南芥根冠细胞高尔基体反面网络的囊泡膜. 以上结果说明, 动植物细胞间GRIP蛋白在高尔基体上的定位是保守的; 同时也说明AtGRIP蛋白可能参与了对植物细胞高尔基体反面网络结构与功能的调控.