乙肝表面抗原在分泌型毕赤酵母中的表达及纯化

目的对分泌型毕赤酵母中表达乙肝表面抗原并进行亲和层析纯化。方法从已确诊的乙肝患者阳性血清中提取乙肝病毒DNA,PCR扩增乙肝病毒表面抗原编码基因S,将其插入含有仅分泌信号肽序列和6个组氨酸纯化标签的毕赤酵母表达载体pPICZα,成功构建了重组表达载体pPICZα—HBVs。电转化酵母菌株GS115,得到重组乙肝表面抗原S的酵母表达菌株。结果诱导培养基BMMY中甲醇终浓度为1％,诱导表达48h重组蛋白表达量及抗原性达到最高。非变性条件下亲和层析纯化后,薄层扫描分析得到纯度超过95％,表达量约为2mg／L的重组蛋白。结论Western-blot和ELISA分析表明,所得产物为乙肝表面抗原S蛋白,其纯度和产量足以免疫小鼠制备单克隆抗体。     

南极产低温蛋白酶菌株Marinobacter sp.R2的发酵条件及酶学性质研究

从南极海域沉积物中筛选到一产蛋白酶的菌株R2，经细菌学形态特征鉴定及16S rDNA序列分析鉴定，该菌株属于海杆菌属(Marinobacter)．生长特性研究表明该菌株属于兼性嗜冷菌，其最适生长温度为10～15℃．R2菌株能利用多种碳源产酶，最适产酶温度为20℃．粗酶液经硫酸铵盐析、DEAE cellulose-52柱层析进行初步分离纯化后进行酶学性质的研究．该菌株所分泌蛋白酶的最适作用温度为20℃，最适pH值为9～10，对热敏感．是典型的低温碱性蛋白酶．Ca^2 、Mn^2 、Cu^2 对该蛋白酶有较为明显的激活作用，而Cd^2 、Co^2 则能抑制酶活．高浓度的变性剂、PMSF、AEBSF和EDTA都能抑制该蛋白酶，表明该酶属于丝氨酸蛋白酶，且金属离子对酶活性中心构象有关键性的影响．     

乌苏里蝮消化道5-羟色胺免疫活性细胞的分布与形态学观察

应用5—羟色胺特异性抗血清，对乌苏里蝮(Gloydius ussuriensis)消化道内分泌细胞进行了免疫组织化学定位。结果表明：5—羟色胺(5—HT)免疫活性细胞在乌苏里蝮消化道各段都有分布，其中幽门部5—HT免疫活性细胞分布密度为最高，食管部最低，同时对其分布型的原因、形态和功能相适应的特点进行了讨论。     

人骨形态发生蛋白6(hBMP6)在毕赤酵母中的分泌表达

以重组质粒pcDNA6A-BMP6为模板PCR扩增hBMP6成熟肽cDNA编码序列,将该序列克隆到酵母分泌表达表达载体pPIC9K中.重组质粒pPIC9K-hBMP6经SacI酶切线性化,电击转化毕赤酵母GS115,PCR法筛选阳性转化子,利用梯度浓度G418筛选到七株高拷贝整合的阳性转化子。用甲醇进行诱导表达,SDSPAGE及Western-blot检测结果表明hBMP6成熟肽以分子量约为34和18 kD两种不同糖基化修饰的单体形式存在,具有良好的免疫原性.     

GABA促进小鼠离体胃胃酸分泌活动的机制探讨

为了探讨γ-氨基丁酸(GABA)对小鼠离体胃胃酸分泌(GAS)的调节作用和机制,在体外37℃缓冲溶液中培育小鼠全胃标本,测定灌流液的pH值。结果表明:丙谷胺(2、6×10-7mol/L),可显著地抑制胃酸分泌。GABA(2～10×10-7mol/L)则以一种浓度依赖的方式显著地促进胃酸分泌,若用丙谷胺(6×10-7mol/L)和不同浓度的GABA共同灌流胃,则显著阻断GABA的促进效应,逻辑斯谛曲线(Logisticcurve)显示这种阻断是不完全的。西咪替丁(Cim,10×10-7mol/L)明显抑制胃酸分泌,并不完全阻断GABA对胃酸分泌的促进效应。若用丙谷胺(6×10-7mol/L)和西米替丁(Cim,10×10-7mol/L)与GABA(4～10×10-7mol/L)共同灌流胃,对GABA促进胃酸分泌的效应仍显示不完全阻断作用。结果提示:GABA可能通过G细胞或/和ECL细胞间接促进壁细胞泌酸;GABA也可能直接激活壁细胞,促进胃酸分泌。     

枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转氨酶的异源表达

以野生型枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增获得带有SD序列及谷氨酸棒状杆菌信号肽ΔS0949的BTG基因.将其与大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌穿梭表达载体pXMJ19连接,构建重组质粒pXMJ19-Sbtg转化谷氨酸棒状杆菌ATCC13032.经IPTG诱导后该重组菌发酵液具有交联酪蛋白的能力,表明该重组菌能够实现分泌表达.     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在干酪乳杆菌中的分泌表达

以大肠杆菌和乳酸菌穿梭表达型载体pMG36e为基本模型,采用重叠延伸PCR方法拼接相关调控元件构建一种乳酸杆菌组成型分泌表达载体;将编码LTB蛋白的eltb基因片段插入干酪乳杆菌分泌型表达载体中,构建重组质粒pMG36e-UP/L-LTB,电转化于干酪乳杆菌393中,筛选获得重组干酪乳杆菌,应用westernblot方法鉴定LTB表达情况.Western-blot分析显示,约有12 KDa的目的蛋白以分泌形式表达,可被LTB阳性血清识别.表明LTB蛋白在重组干酪孔杆菌获得了表达,并且具有免疫反应活性和佐剂活性,为以LTB为分子佐剂研制乳酸菌黏膜疫苗奠定基础.     

燕麦分离蛋白消化特性和消化产物对STC-1细胞分泌胆囊收缩素的影响

为研究燕麦分离蛋白的消化特性及其消化产物对肠内分泌细胞分泌胆囊收缩素(CCK)的影响,以燕麦为原料,采用碱提酸沉法得到燕麦分离蛋白,分析燕麦分离蛋白在模拟胃肠道消化过程中的分子质量变化、氮释放规律、消化产物的氨基酸组成,计算氨基酸评分、化学评分和必需氨基酸指数,并以STC-1细胞为肠内分泌细胞模型评价消化产物对STC-1细胞分泌CCK的影响。实验结果表明:燕麦分离蛋白经胃肠消化后,消化产物的分子质量小于10kDa,释放的可溶性氮的比例为90.11%,消化产物可溶性部分中游离氨基酸的比例为22.8%,肽的比例为67.31%,并且肽的分子质量主要在1000Da以下(约74%);燕麦分离蛋白消化产物中必需氨基酸总量占38.75%,必需氨基酸与非必需氨基酸的比值为0.63,且必需氨基酸指数(0.95)大于0.90。燕麦分离蛋白消化产物对STC-1细胞影响的实验结果表明,燕麦分离蛋白消化产物对STC-1细胞生长具有显著的促进作用,且能够增加CCK的合成和分泌。研究结果表明,燕麦分离蛋白作为一种优质的蛋白质原料,不仅具有优良的营养功能,而且具有促进肠内分泌细胞分泌CCK的生物活性,在食品领域具有较大的应用潜力。     

人血管生成素样蛋白4在毕赤氏酵母中的表达及其生物活性的初步研究

将编码人的血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)的cDNA克隆至分泌表达载体pPIC9k上,在Pichia Pastoris酵母宿主菌SMD1168中获得分泌表达;用MTT方法检测的细胞生长抑制实验结果表明,发酵液中分泌表达的重组蛋白ANGPTL4对人脐静脉内皮细胞的生长具有一定的抑制作用．     

SUR1基因多态性与磺脲类药物疗效的相关性

采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术检测了178例2型糖尿病和132例健康对照者磺脲类药物受体1(SURl)基因外显子16-3c／t多态性，并对其中112例糖尿病患者观察了磺脲类降糖药的疗效．与对照组相比，“t”等位基因频率和“tt”基因型(纯合子)在糖尿病组中的分布显著升高，“tt”基因型患者反映其胰岛素分泌功能的Homap指数较其他基因型(tc和cc)组显著降低，糖尿病中33例磺脲药治疗失效组t等位基因频率明显多于79例磺脲药治疗有效组．提示SURl基因变异可能导致2型糖尿病胰岛素分泌功能障碍，SUR1基因外显子16-3c／t多态性与磺脲类降糖药的疗效间存在连锁不平衡．