SNX12调控BACE1的细胞内定位和Aβ的产生

不溶性β淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)的沉积是阿尔茨海默症(Alzheimer′s disease,AD)的中心环节,Aβ是由β-分泌酶(BACE1)和γ-分泌酶顺序切割β淀粉样蛋白前体蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)产生的,BACE1与APP在质膜、内含体/溶酶体、高尔基体反面膜囊(TGN)以及早期分泌途径之间的转运很大程度上影响了Aβ的产生.通过Western blot和免疫荧光的方法探讨了Sorting nexin12(SNX12)对Aβ产生的影响及其作用机制.Western blot结果显示过表达SNX12后,分泌到细胞外的Aβ减少,γ-分泌酶的活性及PS1、NCT、pen-2、APP和BACE1的蛋白水平没有明显变化,APP-βCTF水平降低,而下调SNX12时Aβ水平增加,与对照组相比,差异均具有统计学意义(p<0.05);免疫荧光结果表明,SNX12与BACE1在细胞内存在共定位,并且SNX12表达增加可以使BACE1和APP在细胞内处于同一区域的数量减少.这些结果表明,过表达SNX12通过调节BACE1在细胞内的定位,使细胞内处于同一区域的BACE1与APP的数量减少,导致经BACE1切割的APP减少,从而降低Aβ的产生.因此SNX12可能在AD的发病过程中起着一定的调节作用.     

产人胰岛素毕赤酵母工程菌的构建

根据人胰岛素的氨基酸序列和酵母偏爱的密码子,采用基因半合成技术合成人胰岛素基因.将合成的胰岛素基因克隆到pP IK 9质粒,构建了毕赤(P ich ia)酵母重组表达载体pP IN S319,用B g lⅡ线性化后用电转化法导入毕赤酵母G S ll5菌株,经过营养筛选和PCR复筛,得到含人胰岛素基因的毕赤酵母工程菌株.经SDS-PAGR和密度扫描分析表明,合成的人胰岛素基因能够在毕赤酵母中高效分泌性表达,表达量可达0.563 m g/mL,表达产物无需转肽过程,只经过胰蛋白酶和羧肽酶B简单处理即得到优质重组人胰岛素,其体内活力约为30 IU/m g.     

结核分枝杆菌多价核酸疫苗的构建及免疫原性

将编码结核分枝杆菌MPT-64，Ag85B和ESAT-6分泌蛋白的结构基因或包括信号肽的全基因序列定向克隆到真核表达载体pJW4303中，转化到TOP10大肠杆菌，提取质粒DNA，经限制性核酸内切酶鉴定及序列分析证实含有正确的上述3种分泌蛋白的结构基因（包括信号肽）全序列，用脂质体介导法将重组表达质粒导入COS7细胞内并进行瞬时表达，收集表达细胞或浓缩上清液，12%或15%的SDS-PAGE电泳分离，用结核杆菌特异性抗体进行免疫印迹杂交，证明上述3种重组质粒能在哺乳动物细胞中表达出特异蛋白，3种重组表达质粒同时肌注免疫小鼠21d后，Ag85B抗体的平均滴度即达到1：3200，第2次免疫21d达到1：102400，MPT-64抗体的平均滴度在首免21d后为1：50，第2次免疫21d后为1：200，两次免疫21d后均未检测到ESAT-6的特异性抗体，三免21d后Ag85B的特异性细胞因子γ-干扰素的浓度为110pg/mL；面MPT-64和ESAT-6的γ-干扰素浓度未检测到，实验在国内首次用结核杆菌多价DNA疫苗对小鼠进行了免疫实验，二免后的抗体水平已达到或超过国内外已报道的单价苗最高抗体水平，表明多价核酸疫苗和分泌型蛋白载体有利于增强疫苗的保护性应答。     

南极假丝酵母脂肪酶B在毕赤酵母中的分泌型表达及酶学性质初探

将南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)基因克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA(含pAOX1启动子)和pGAPZαA(含pGAP启动子)中,转入毕赤酵母表达宿主KM71H,经三丁酸甘油酯平板活性筛选获得高效表达的酵母工程菌株.分泌型表达CLAB酵母工程菌的酶活较高,经摇瓶发酵96h后,CLAB活力达到11.1U/mL.经发酵罐高密度发酵84h后,CLAB活力达到179.2U/mL,蛋白质量浓度为1.36mg/mL.体积分数12%SDS-PAGE凝胶电泳显示重组CALB相对分子量为36kDa.该酶最适温度为40℃,最适pH值为8.0.在pH7.5~9.5较稳定,经55℃保温1h,残余酶活还有48.5%.5mmol/LMg2+、Ni+、Co2+和体积分数0.10%SDS对CALB酶活影响很小,而Zn2+强烈抑制酶催化反应,体积分数0.05%TritonX-100对CALB稍有激活作用.     

银杏分泌腔发生和发育的解剖学研究

在光学显微镜下对银杏的叶,茎,根器官分泌腔的发生及发育进程进行了观察和研究,结果表明除根中没有分泌腔外,其它器官的分泌腔均以相同的方式发生。分泌腔是以裂溶生方式形成的。分泌腔原始细胞是一团排列紧密,原生质很浓,染色较深的细胞,其周围被液泡化的细胞所包围,随着分泌腔的发育,这些细胞逐渐液泡化,并向四周移动,形成一个空腔,当空腔增大一定程序后,内层分泌细胞部分溶解,且少于腔内。在分化后期,分泌腔由一层梁色很深的环带状结构的分泌细胞和薄壁性鞘状细胞所包围。     

大气酸沉降对马尾松幼苗根系生理特性的影响

马尾松 (Pinus massoniana) 是我国人工林的重要组成树种,对酸沉降高度敏感。随着我国大气酸沉降的日趋严重,马尾松林出现针尖坏死,树枝枯萎,甚至死亡等受害症状。木本植物响应酸沉降根系生理变化过程的研究相对较少,酸沉降对马尾松根系生理特性的影响仍不清楚。笔者研究马尾松幼苗根系生理指标在不同酸沉降强度和时间下的变化,探究马尾松根系对大气酸沉降的适应能力。     

酵母Elp3在毕赤酵母中的分泌表达及活性测定

酵母Elp3是Elongator复合物的催化亚基,可参与组蛋白乙酰化修饰与基因转录延伸.生物信息学分析及有关研究表明Elp3除组蛋白乙酰转移酶(Histone acetyltranferase,HAT)活性外,可能还拥有组蛋白去甲基化酶活性.本文以yElp3的pYES2yElp3质粒为模板,PCR获得yElp3基因全长,插入改造过的毕赤酵母表达载体pPIC9KH,转化巴斯德毕赤酵母GS115菌株.经表型鉴定、PCR分析及G418筛选获Mut+型多拷贝整合菌,经0.5%的甲醇诱导和Ni-NTA纯化,得到目的蛋白并对其进行体外酶活测定.SDS-PAGE分析表明yElp3在毕赤酵母中实现了高效分泌表达,Western印迹证实得到的蛋白为yElp3.OPA法测得纯化蛋白拥有较好的HAT活性,具有生物活性的Elp3蛋白的获得为体外测定其第二结构域是否有催化活性奠定了基础.     

日本曲霉酸性蛋白酶的分泌表达、性质及其在猪肉嫩化中的应用

为研究日本曲霉酸性蛋白酶的分泌表达、性质及其在猪肉嫩化中的应用。将日本曲霉来源的酸性蛋白酶基因(AjproA1)在毕赤酵母中高效表达,经5L发酵罐高密度发酵后测得该酸性蛋白酶酶活力为669.6U·mL^-1,蛋白质量浓度为6.64mg·mL^-1。氨基酸多重序列比对结果表明:该酸性蛋白酶属于天冬氨酸蛋白酶A1家族,与海枣曲霉来源的酸性蛋白酶同源性最高(73%),是一个新型的酸性蛋白酶。采用强阴离子交换层析柱对该酸性蛋白酶进行纯化得到电泳级纯酶,纯化后分析测得该重组酸性蛋白酶(AjproA1)的最适催化条件为pH值3.0,反应温度为45℃,在pH值为3.0~6.0及温度为40℃以下具有良好的稳定性。该酸性蛋白酶对不同蛋白质水解的分析结果表明,该酶底物水解特异性广泛,对酪蛋白组分中的κ-酪蛋白表现出最高水解活力。利用该酸性蛋白酶对猪肉进行处理,发现该酶能够有效降低猪肉剪切力,起到嫩化效果。研究结果旨在为新型酸性蛋白酶的开发及其在肉类嫩化中的应用提供理论参考。     

耳内镜下低温等离子鼓膜打孔治疗儿童分泌性中耳炎

目的:探讨低温等离子鼓膜打孔技术在儿童分泌性中耳炎外科治疗中的应用及其优势。方法:选取2016年1月至2021年4月期间诊断为分泌性中耳炎并有住院手术指征的患儿79人(共127例患耳),随机分为3组：低温等离子鼓膜打孔组、鼓膜切开组及鼓膜置管组，对比3组治疗方式在治疗有效率、术后感染、遗留穿孔等方面的差异。结果:术后第1月3组的有效率分别是100.00%、66.67%、96.15%(P<0.05);术后第6月3组有效率分别是100.00%、89.58%、92.00%(P>0.05)。术后1月有效率比较，鼓膜置管组与鼓膜切开组以及低温等离子鼓膜打孔组与鼓膜切开组差异均具有统计学意义(P<0.05);而低温等离子鼓膜打孔组与鼓膜置管组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。在术后第1月及第6月，3组术后并发急性中耳炎病例数差异均无统计学意义(P>0.05)。在术后第6月3组出现鼓膜穿孔的病例数差异也无统计学意义(P>0.05)。结论:低温等离子鼓膜打孔可作为儿童分泌性中耳炎外科治疗的一个有效的选择，其操作简便，而且具有安全性和微创性。