γ干扰素工程菌发酵工艺研究

在摇瓶培养及恒化培养研究的基础上,对含温度敏感型质粒γ干扰素工程菌高密度、高表达的发酵工艺作了探讨。摇瓶培养结果表明,菌体的良好生长状态对外源基因表达起着重要作用,工程菌于对数后期升温,干扰素滴度最高。以葡萄糖为限制性基质的恒化培养,得出了工程菌细胞生长得率与比生长速率之间的关系,同时表明工程菌升温表达前的比生长速率对表达后干扰素的比活有影响,比生长速率在0.10～0.15h~(-1)时比活最大。通过碳、氮、镁的间歇流加培养与连续流加培养,均使工程菌达到高密度与高表达,但以控制比生长速率为目的的连续流加培养较间歇流加比活提高近4倍,棕1.1×10~(10)IU/L。     

鼠转移抑制基因（nm23—1）在大肠杆菌中的高效表达及活力鉴定

肿瘤转移是引起恶性肿瘤患死亡的主要。对肿瘤抑制基因的研究在临床上具有重要意义。ｎｍ２３基因是目前研究得较多和认为最有前途的肿瘤抑制基因，它已从小鼠黑色素瘤细胞系Ｋ－１７３５中克隆得到。     

不同培养条件对基因工程疫苗菌抗原蛋白表达的影响

基因工程菌的表达条件研究在现代生物高技术产业化的发展中具有重要的意义。影响基因工程菌表达的因素主要有pH值、温度、诱导剂IPTG的浓度、诱导时间等。笔者分别就以上因素对基因工程菌抗原蛋白表达的影响进行了初步研究。在摇床培养条件下，外源基因表达蛋白的最适表达条件为终浓度O．8mmol/L的IPTG，32℃，诱导6h。     

栖热菌噬菌体TSP4密码子偏嗜性及其对基因异源表达的影响

 为了探索噬菌体TSP4、栖热菌模式菌株Thermus thermophilus HB27中6种蛋白编码序列和Escherichia coli基因组遗传密码子使用偏嗜性,探索TSP4基因密码子偏嗜性对其基因异源表达的影响本研究利用生物学软件Editseq和RSCU算法统计噬菌体TSP4密码子使用频率并分析其偏嗜性,与栖热菌HB27的同源基因以及常温菌E.coli基因组的密码子使用偏嗜性进行对比分析.结果显示,噬菌体TSP4与栖热菌HB27优势密码子相似度高达85%,而与E.coli的相似性仅有65%.为了验证分析结果,选取TSP4基因组中一个潜在分子伴侣基因序列在E.coli BL21和E.coli Rosetta(补充了BL21菌株中缺失的6个稀有密码子)中进行异源表达.噬菌体TSP4与其宿主菌HB27之间密码子高相似性说明在长期的进化过程中TSP4在基因水平上形成对宿主的一种适应性机制.异源表达结果显示,分子伴侣基因在E.coli BL21中未见明显表达,但在Rosetta中高效表达,说明Rosetta中补充的 6个稀有密码子明显有助于分子伴侣基因的表达,该结果也进一步证明密码子偏嗜性是否一致在很大程度上影响基因的表达.     

大肠杆菌BL21(DE3)氨基葡萄糖代谢调控相关基因的敲除及glmS在其中的表达研究

氨基葡萄糖(Glucosamine,GleN)是一类广泛使用的保健品,对于人类软骨再生及关节炎的临床治疗都具有良好的疗效.为构建以代谢工程为基础的氨基葡萄糖生产菌株,采用λRed同源重组系统将大肠杆菌BL21(DE3)中甘露糖-磷酸转移酶系统操纵子(manXYZ)和乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)转运和代谢特异性系统操纵子(nagBACD-nagE)进行双剔除.随后构建含新型氨基葡萄糖合成酶基因(glmS)的表达载体pETG,并将它转化该双操纵子剔除菌株.结果表明,改造后的菌株不能以GleN或GlcNAc作为碳源进行代谢生长.表达GlmS菌株的上清液经Ni-NTA亲和层析纯化,其酶活性达8.63 U/mg,表明该菌株已具备发酵生产GleN的初步特性.     

人硫氧还蛋白存在不同的选择性剪切形式

利用RT_PCR技术、基因克隆化和基因表达技术 ,首次在人胎肝细胞中发现了人硫氧还蛋白 (hTRX)的另外一种选择性剪切形式 (hTRXδ3) .经测序证实hTRXδ3缺失正常hTRX第 3外显子的 6 0bp ,无其他编码区域改变 ,其酶活性位点依然存在 .经大肠杆菌表达重组蛋白的活性分析 ,hTRXδ3依赖DTT催化胰岛素还原的活性明显低于完整的hTRX蛋白 .本文结果为进一步研究hTRX的结构与功能提供了基础     

利用实验细菌种群的元素表型尝试构建适应性景观

适应性景观这一概念激发了进化生物学领域内的许多研究,它的性质对预测种群进化过程具有重要意义.理论研究预测了多种景观的形态,但能被实验数据支持的还很少,因为实验构建适应性景观非常困难.一些微生物实验进化研究通过分析种群进化的可重复性,间接推测了景观的崎岖性,但不能给出其拓扑结构的具体信息.本研究尝试将适合度数据映射到表型空间的办法来直接呈现适应性景观的形态.共使用9个不同基因型的大肠杆菌株系作为祖先,对每个基因型建立6个重复家系,在一个限定养分的环境中对这54个种群进行了约1 100代的选择实验.在考察后代种群对选择环境响应(菌株的氮、磷质量分数w及适合度变化)的同时,利用进化断点处的实测数据信息,通过局域多项式回归拟合的方法,构建了基于细菌元素表型的适应性景观.研究发现,不同菌株家系对相同的选择环境表现出不同的响应模式;大部分后代种群相比其祖先提高了适应性;适应性景观呈现崎岖多峰的形态.     

载银活性碳纤维对大肠杆菌的灭菌作用

采用真空浸渍加热分解的方法制备了载银活性碳纤维（ＡＣＦ（Ａｇ））。以大肠杆菌为研究对象,用抑菌环试验研究了ＡＣＦ（Ａｇ）的灭菌性能以及银含量、银颗粒大小及原始活性碳纤维（ＡＣＦ）的比表面积等因素对其灭菌性能的影响规律。结果表明,ＡＣＦ（Ａｇ）的灭菌性能随银含量和比表面积的增加而加强,在银含量相同时,其灭菌性能随银颗粒的减小而增强。     

在大肠杆菌中直接克隆白腐丝状真菌-黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)基因启动子

利用启动子探钍型载体ｐＳＵＰＶ４ 直接在大肠杆菌细胞中克隆到多个来自白腐丝状真菌－黄孢平革菌（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ）的基因启动子片段．这些基因启动子片段能在大肠杆菌细胞中启动重组卡那霉素抗性基因（ｒｋａｎｒ）的表达,不同片段赋予宿主细胞以不同的卡那霉素抗性水平,最高的可达１０００μｇ／ｍ Ｌ,最低的则为５０μｇ／ｍ Ｌ．琼脂糖凝胶电泳显示这些重组质粒ＤＮＡ 中均有不同大小的插入片段,其范围是０．５～６．０ｋｂ．选取一个插入３．９ｋｂ 的重组质粒ｐＰＣ３３ 所作的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交结果表明,插入片段以单拷贝形式存在于Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ 的基因组中．当此片段５′－端被除去１．８ｋｂ 后,余下的２．１ｋｂ 片段可使融合的Ｋａｎｒ 基因的表达效率提高６０％ ．     

模块化工程大肠杆菌从头合成丁香酚

丁香酚是一种绿色生物农药,主要用于防治番茄灰霉病、葡萄霜霉病和马铃薯晚疫病等主要的农业病害.目前丁香酚是从丁香和罗勒等植物中提取制备,其规模和产能受到限制,还存在废渣排放影响生态环境的问题.本研究采用合成生物学和模块化工程策略,设计构建工程大肠杆菌,以期微生物从头合成丁香酚.将丁香酚异源合成途径分成3个模块,分别是上游...