鼠转移抑制基因（nm23—1）在大肠杆菌中的高效表达及活力鉴定

肿瘤转移是引起恶性肿瘤患死亡的主要。对肿瘤抑制基因的研究在临床上具有重要意义。ｎｍ２３基因是目前研究得较多和认为最有前途的肿瘤抑制基因，它已从小鼠黑色素瘤细胞系Ｋ－１７３５中克隆得到。     

不同培养条件对基因工程疫苗菌抗原蛋白表达的影响

基因工程菌的表达条件研究在现代生物高技术产业化的发展中具有重要的意义。影响基因工程菌表达的因素主要有pH值、温度、诱导剂IPTG的浓度、诱导时间等。笔者分别就以上因素对基因工程菌抗原蛋白表达的影响进行了初步研究。在摇床培养条件下，外源基因表达蛋白的最适表达条件为终浓度O．8mmol/L的IPTG，32℃，诱导6h。     

VMIP—Ⅱ肽在大肠杆菌中的双辅助助子高效表达

目的构建病毒趋化因子(vMIP-II)基因表达载体并在大肠杆菌中以辅助折叠和辅助阻遏方式高效表达vMIP-II重组肽. 方法用PCR法获得vMIP-II基因片断,将其插入表达载体pQE,构建重组表达载体pEh-vMIP. 表达载体、辅助折叠子和辅助阻遏子载体共转染大肠杆菌DH5α,用酶切、DNA测序、PCR扩增鉴定阳性克隆. 结果阳性重组子在大肠杆菌细胞中经IPTG诱导可高效表达vMIP-II重组肽,蛋白电泳分析可观察到一相对分子质量与理论值相符(约8×103)的诱导表达条带, 其表达量约占菌体总蛋白的20%. 分析表明,vMIP-II重组肽主要以可溶性形式表达. 结论用双辅助技术在大肠杆菌中高效表达较小相对分子质量vMIP-II的成功,为进一步研究vMIP-II的功能及应用奠定基础,也为同类小分子、易降解的肽类物提供基因工程表达方法.     

栖热菌噬菌体TSP4密码子偏嗜性及其对基因异源表达的影响

 为了探索噬菌体TSP4、栖热菌模式菌株Thermus thermophilus HB27中6种蛋白编码序列和Escherichia coli基因组遗传密码子使用偏嗜性,探索TSP4基因密码子偏嗜性对其基因异源表达的影响本研究利用生物学软件Editseq和RSCU算法统计噬菌体TSP4密码子使用频率并分析其偏嗜性,与栖热菌HB27的同源基因以及常温菌E.coli基因组的密码子使用偏嗜性进行对比分析.结果显示,噬菌体TSP4与栖热菌HB27优势密码子相似度高达85%,而与E.coli的相似性仅有65%.为了验证分析结果,选取TSP4基因组中一个潜在分子伴侣基因序列在E.coli BL21和E.coli Rosetta(补充了BL21菌株中缺失的6个稀有密码子)中进行异源表达.噬菌体TSP4与其宿主菌HB27之间密码子高相似性说明在长期的进化过程中TSP4在基因水平上形成对宿主的一种适应性机制.异源表达结果显示,分子伴侣基因在E.coli BL21中未见明显表达,但在Rosetta中高效表达,说明Rosetta中补充的 6个稀有密码子明显有助于分子伴侣基因的表达,该结果也进一步证明密码子偏嗜性是否一致在很大程度上影响基因的表达.     

大肠杆菌BL21(DE3)氨基葡萄糖代谢调控相关基因的敲除及glmS在其中的表达研究

氨基葡萄糖(Glucosamine,GleN)是一类广泛使用的保健品,对于人类软骨再生及关节炎的临床治疗都具有良好的疗效.为构建以代谢工程为基础的氨基葡萄糖生产菌株,采用λRed同源重组系统将大肠杆菌BL21(DE3)中甘露糖-磷酸转移酶系统操纵子(manXYZ)和乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)转运和代谢特异性系统操纵子(nagBACD-nagE)进行双剔除.随后构建含新型氨基葡萄糖合成酶基因(glmS)的表达载体pETG,并将它转化该双操纵子剔除菌株.结果表明,改造后的菌株不能以GleN或GlcNAc作为碳源进行代谢生长.表达GlmS菌株的上清液经Ni-NTA亲和层析纯化,其酶活性达8.63 U/mg,表明该菌株已具备发酵生产GleN的初步特性.     

大肠杆菌染色体复制起始调控

大肠杆菌染色体具唯一一个复制原点叫oriC.在oriC上染色体的复制起始是个严格控制的细胞过程.首先,复制起始蛋白DnaA与oriC上DnaA框相互作用,使DNA分子弯曲,并在IHF和HU等蛋白的帮助下,使oriC双链DNA在其富含AT区解链,便起始复制.DnaA蛋白有两种形式,即ATP-DnaA和ADP-DnaA,前者有复制起始活性,后者则没有.DnaA蛋白浓度的提高和由DRAS使ADP-DnaA激活为ATP-DnaA都会导致额外的复制起始,说明ATP-DnaA是个复制起始正调控因子.DiaA蛋白通过与ATP-DnaA的相互作用来促使ATP-DnaA-oriC复合物的形成,从而激发复制起始.然而,在每个细胞周期中,DNA复制起始只发生一次.有不同的分子机制抑制在同一个细胞周期的同一复制原点上重复起始复制.1)复制原点的隔绝防止复制起始.由SeqA蛋白结合在oriC中半甲基化的多个GATC位点,使oriC失去复制起始活性;2)由RIDA使ATP-DnaA降解为ADP-DnaA,使DnaA失去复制起始活性;3)Dps蛋白抑制依赖DnaA蛋白的oriC解链;4)datA序列通过降低作用于oriC的DnaA可用量来延缓复制起始时间.显然,一个复杂的调控网络控制着复制起始.本文回顾、总结和分析了大肠杆菌复制起始调控机制.     

仔猪下痢的病因及综合防治措施

仔猪下痢是由致病性大肠杆菌引起的急性传染病,在仔猪生产中广泛存在,它不仅给养猪业带来直接经济损失,还间接地影响到病愈猪的生长发育,成为影响养猪业经济效益的重要制约因素。虽然有多种防治仔猪下痢的生物菌苗,如母猪产前接种的k88、k99、987p、混合菌苗,以及仔猪服用的NYIO菌苗等,但由于病因的多样性,加上各养殖户、猪场的防治体系不完善,该病经常发生。现结合临床诊疗经验,就该病的发病原因与综合防治总结如下。     

超高压对哈密瓜汁中大肠杆菌杀灭效果研究

本实验采用非热处理方式加工哈密瓜汁即采用超高压对新鲜哈密瓜汁进行处理。研究超高压处理时不同温度、压力、时间对于哈密瓜汁中大肠杆菌的杀灭效果,并且结合对其处理前后大肠杆菌超微结构的观察得出超高压处理哈密瓜汁的最佳参数。     

人硫氧还蛋白存在不同的选择性剪切形式

利用RT_PCR技术、基因克隆化和基因表达技术 ,首次在人胎肝细胞中发现了人硫氧还蛋白 (hTRX)的另外一种选择性剪切形式 (hTRXδ3) .经测序证实hTRXδ3缺失正常hTRX第 3外显子的 6 0bp ,无其他编码区域改变 ,其酶活性位点依然存在 .经大肠杆菌表达重组蛋白的活性分析 ,hTRXδ3依赖DTT催化胰岛素还原的活性明显低于完整的hTRX蛋白 .本文结果为进一步研究hTRX的结构与功能提供了基础     

人RANKL胞外结构域原核表达载体的构建及表达条件优化

细胞核因子κB受体活化因子配体(Receptor activator of the NF-κB ligand,RANKL)是TNF超家族的重要成员之一,属于Ⅱ型跨膜蛋白,通过与其受体核因子κB受体活化因子(RANK)构建的信号通路参与乳腺癌的发生、肿瘤骨转移、骨质疏松、关节炎等病理过程。人RANKL胞外结构域基因片段与原核表达载体pET-21b融合并转化至表达菌Rosetta,并对其表达条件进行了优化。通过对诱导时机,诱导温度,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)浓度,诱导时间及甘油浓度的条件优化表明,当IPTG的浓度为0.2 mmol/mL,20℃振荡诱导培养6 h时,甘油浓度为4%时,可在上清中获得高效表达的pET-21bRANKL融合蛋白,为该蛋白的进一步纯化及结构与功能研究打下了良好的基础。