耐热性重组Taq DNA酶的制备及鉴定

利用含Taq DNA聚合酶基因的pTaq表达质粒转化大肠杆菌E.coli菌株,用异丙基硫代-β-D-乳糖苷(IPTG)诱导10～12h表达耐热Taq DNA聚合酶;然后溶菌酶、NP40裂解细菌;硫酸铵沉淀、4℃下透析;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、考马斯亮蓝法和PCR分析其纯度、浓度和活性。结果表明分离纯化制备的耐热性Taq DNA聚合酶,其纯度、浓度和活性均可与同类产品相比,比活性达20000U/mg,能有效扩增出DNA片段。     

濒危植物刺桫椤RAPD反应体系的优化

以高盐SDS法提取濒危植物刺桫椤(Alsophila spinulosa)嫩叶总DNA，进行RAPD分析，分别研究了模板DNA、引物、dNTP、Mg^2 和Taq DNA聚合酶用量以及反应体积对反应结果的影响．筛选并建立了适合于利桫椤RAPD扩增的反应体系：反应体积10μL，内含2ng/μL模板DNA，2．0mmo1/L MgCl2,0．3μmo1／L引物，300μmo1／L dNTP，0．5u Taq DNA聚合酶．     

人类线粒体转录因子B1和B2与裂殖酵母线粒体转录聚合酶Rpo41相互作用的初步研究

由L02型人肝脏细胞cDNA通过PCR技术获取到线粒体转录因子B1和B2的ORF片段(NM_022366和NM_016020);构建表达质粒pGEX-4t-1/GST-mtTFB1及pMAL-c-2X/MBP-mtTFB2,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达,经亲和层析,分子筛和阳离子交换柱得到纯度较高的蛋白.利用体外pull-down实验证实TFB1和TFB2均与来源于裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的线粒体RNA聚合酶(Rpo41)存在分子间相互作用.在裂殖酵母中过表达h-TFB1和h-TFB2,利用实时荧光定量PCR检测,2个蛋白在酵母体内均对线粒体基因转录产生影响.     

PCR扩增检测献血者中TT病毒DNA及部分TTV基因序列分析

目的：了解江苏地区献血者中新型肝炎相关病毒－－TT病毒的感染状况,探讨TTV感染与ALT异常的相关性,方法：设计通用引物,采用半套式聚合酶链反应（hemi-nested PCR)方法检测195份献血者血清标本,结果,在血清丙氨酸转氨酶（ALT）异常,HBsAg及抗HCV阴性的99份献血者血清标本中,检出TTV DNA阳性标本36份,TTV DNA的阳性检出率为36．3％,而在96份正常献血者血清标本中,检出TTV DNA阳性标本16份,TTV DNA阳性检出率为16．6％,明显低于ALT常献血者人群,对2株阳性株序列分析结果显示,一株与TX011（G1b日本代表株）的同源性为98．6％,属于G1b亚型,另一株虽可归属于G1,但与G1a ,Blb差异较大,可能为G1的新亚型,结论：江苏地区献血者人群中存在TTV感染,国内首次报告检出TTV G1b亚型及新的亚型,献血者ALT异常与TTV感染密切相关,输血可能成为传播TTV感染的途径之一。     

对动物组织DNA提取方法的改进及PCR检测

以小型哺乳动物社鼠为例,通过调整酚与氯仿的比率、减少抽提次数及消化时间,对采用-70℃超低温冰箱、-20℃低温冰箱、70%乙醇液浸泡、95%乙醇液浸泡和含50 mmoL/L乙二胺四乙酸二钠的70%乙醇液浸泡等不同方法保存的社鼠肌肉组织提取基因组DNA,并对其进行微卫星指纹图谱分析,研究了改进方法对不同方法保存的社鼠肌肉组织提取DNA的效果,并比较了不同保存方法对DNA提取效果的影响.结果表明:改进方法可行,完全可以满足微卫星等分子标记技术的需要.     

乙肝患者胎盘MDR1 mRNA表达及意义

目的:探讨MDR1 mRNA在乙肝患者胎盘组织中的表达及其意义。方法:选取乙肝患者足月胎盘20例;选择正常产妇足月胎盘20例作为正常对照组。实时荧光定量RT-PCR分别检测两组产妇胎盘中MDR1mRNA的表达。结果:各组荧光定量PCR检测MDR1mRNA的相对表达量为乙肝组(0.454±0.398),正常组(0.086±0.099),与对照组相比,差异有显著性(P<0.001)。结论:MDR1mRNA在胎盘组织中表达的升高,可能与乙型肝炎病毒感染有关。     

厌氧活性污泥微生物群落的SSCP分析条件优化

针对厌氧活性污泥微生物群落结构复杂,群落中相似基因序列较多等特点,对影响单链构像多态性(SSCP)图谱分辨率的电泳温度、甘油、交联度和影响聚合酶链式反应(PCR扩增)的BSA等因素进行了实验研究。结果表明,选择细菌16SrDNAV3区(约200bp)PCR扩增片段,在凝胶浓度为12%、丙烯酰胺与双丙烯酰胺质量比为49:1、无甘油等条件下,恒压260V,4℃电泳17h,可获得较为理想的SSCP图谱;BSA的使用,有助于降低样品中残留腐殖酸和棕黄酸等杂质对PCR扩增的抑制作用,提高SSCP图谱的分辨率和可读性,为厌氧活性污泥细菌群落结构解析提供了有效手段。     

PARP2突变恢复parg1突变体对基因毒剂敏感表型的机理研究

蛋白质多聚ADP核糖化是一种翻译后修饰方式,拟南芥中有3个编码多聚ADP核糖化聚合酶的基因(PARP1,PARP2和PARP3)和两个编码多聚ADP核糖水解酶的基因(PARG1和PARG2),其中PARG1突变体parg1-4对基因毒剂极其敏感,为了了解PARP家族成员PARP2基因与parg1突变体表型的关系,本研究将PARP2突变体parp2-3与parg1-4杂交获得了parp2-3parg1-4双突变体,发现PARP2突变部分恢复了parg1-4对双链断裂基因毒剂zeocin和单链断裂基因毒剂MMS敏感的表型.Western blot结果显示:在zeocin和MMS处理下,parp2-3parg1-4中的PAR信号强度与parg1-4中的相比大大降低.实时荧光定量PCR结果显示:在zeocin和MMS处理下,parg1-4中响应DNA损伤的基因在胁迫初期被显著诱导,胁迫后期与细胞死亡相关的基因表达量明显高于其他基因型植物,但PARP2突变后,parp2-3parg1-4中PAR水平和损伤及死亡基因的表达量均降低,从而部分恢复了parg1-4的敏感表型.     

基于BLOCK-iTTM的RNA干扰序列设计与PCR验证

RNA干扰(RNAi)是经典的基因表达下调工具,多数实验室将RNAi的序列设计工作委托公司完成。本研究以BAIAP2L1和DDIAS基因为例,选择ThermoFisher公司的BLOCK-iTTMRNAi Designer设计工具自行设计siRNA序列,并通过实时荧光定量PCR检测基因表达水平,验证干扰效果。结果显示基因表达水平下调能够达到70%以上,实现良好的RNAi效果,表明通过BLOCK-iTTMRNAi Designer自行设计获得的siRNA序列能够满足预期的基因表达下调。     

腺苷化酶的研究进展

腺苷化修饰(AMPylation)是一种由腺苷化酶(AMPylators)催化的翻译后修饰.腺苷化酶是一类催化底物蛋白的某些残基侧链共价结合(或去除)一磷酸腺苷(adenosine 5’-monophosphate,AMP)的酶.腺苷化酶主要属于Fido结构域超家族和类DNA聚合酶家族(DNA-polymerase-β-like family).致病菌表达腺苷化酶调控宿主细胞的信号机制,达到利于致病菌繁殖和生存的目的.真核生物中也存在一些腺苷化酶参与感知和调控细胞应激.从腺苷化酶的分类、催化机理、调控方式和去腺苷化修饰活性等方面综述了腺苷化酶的研究进展.