构建的Flt3L胞外域原核表达载体在大肠杆菌中的表达

目的：构建含组氨酸标签的FMS样酪氨酸激酶3配体（Fms—like tyrosine kinase 3 ligand,Fh3L）胞外域蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。方法：依据Fh3L基因序列设计引物,以RT—PCR的方法从小鼠脾脏总RNA中克隆Fh3L基因并构建其胞外域原核表达载体,测序鉴定后在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中诱导表达,用免疫印迹鉴定。结果：克隆到Flt3L编码区全长序列,经DNA测序证明与已报道的序列相同;构建羧基端带有His6标签的Flt3L胞外域蛋白的原核表达载体,转化大肠杆菌后SDS-PAGE分析显示在BL21（ED3）中获得较高表达;免疫印迹分析表明IPTG诱导后表达的Flt3L胞外域蛋白的相对分子质量（Mr）为19000,与理论值相符,此蛋白与抗His6标签的抗体发生特异性反应。结论：成功克隆Flt3L基因,构建其胞外域蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得表达。     

枯草杆菌纳豆激酶基因在大肠杆菌中的优化高效表达

在克隆、表达纳豆激酶基因的基础上,对IPTG浓度以及诱导时间两个重要影响因子进行优化选择.结果表明,在IPTG 100μg/mL诱导2.5h时,纳豆激酶的表达量相对较高,约占菌体蛋白重量的46.63%,为实验最佳的诱导条件.     

有活性的激酶C受体(Rack1)在大鼠胚胎植入中的作用

目的:探讨有活性的激酶C受体(receptor for activated C kinase, Rack1)与胚胎着床及蜕膜化的关系.方法:建立大鼠早期妊娠、假孕、延迟着床和人工诱导蜕膜化模型,收集各种模型的子宫材料,利用激光共聚焦显微术检测了Rack1在大鼠子宫中的表达.结果:Rack1在妊娠第6～9天的子宫蜕膜上强表达;假孕第6～9天和延迟着床的大鼠子宫腔上皮下基质中无明显的免疫信号,而延迟着床激活胚胎周围的腔上皮下基质中有强的免疫信号.蜕膜化子宫中整个蜕膜区呈强的免疫染色信号.结论:Rack1蛋白的表达与胚胎着床及蜕膜化过程密切相关.     

不同纳豆配方的营养成分分析研究

目的:分析不同纳豆配方中氨基酸、总黄酮、总糖等营养成分和C/N比,为下一步开展工业化生产提供科学依据。方法:氨基酸分析依据国标GB/T 5009.124—2002、GB/T 5511—2008采用(835-50型)氨基酸分析测定仪检测;总黄酮、总糖依据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)国标GB/T 5009.8—2008检测,将总葡萄糖和总氨基酸之比作为评价配方中C/N比指标。结果:和传统纳豆比较,薏米纳豆和苦荞纳豆氨基酸比例及C/N比下降,总黄酮、总糖含量大大提高,还改善了纳豆的不良气味,增强了纳豆的营养保健作用。     

各类型食管癌组织中CDK16的表达及意义

采用组织芯片技术结合免疫组织化学技术检测各类型食管癌(鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌)以及食管胃交界癌、胃癌中细胞周期素依赖性激酶16(cyclin dependent kinase 16,CDK16)的表达情况.使用数学统计分析软件研究CDK16蛋白的表达与食管鳞癌临床病理特征之间的关系.结果显示,CDK16在不同类型食管癌中的表达存在差异.CDK16在食管鳞癌中呈强阳性表达,且表达强度与肿瘤的分化程度负相关.CDK16在食管鳞癌细胞中表达部位的变化与肿瘤的恶性程度密切相关.CDK16的表达与食管鳞癌患者的性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤最大径及肿瘤的病理形态均没有显著相关性(P0.05),而与肿瘤的病理分级、淋巴结转移及TNM临床分期有显著相关性(P0.05).以上结果表明,CDK16在食管癌中的表达具有组织学特异性.CDK16在食管鳞癌的发病过程中发挥着重要的作用,而检测CDK16的表达有助于食管鳞癌的临床诊断.     

高效溶栓菌株的筛选鉴定及发酵条件优化

采用酪蛋白平板法,从纳豆激酶胶囊、纳豆及多种发酵食品中筛选出了146株产溶栓酶菌株;然后利用纤维蛋白平板法比较发酵后溶栓酶活力,并从初筛菌株中筛选出1株溶栓酶活达1 637.6 IU/mL的高产菌株HT8;依据菌种形态和生理生化特征以及16S rRNA基因序列分析,鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).在此基础上,对此高效溶栓菌株的液体培养条件进行了单因素初步实验,方差分析后设计正交试验L18(37),通过软件SPSS分析确定该菌最佳发酵条件为初始pH值8.0、温度40 ℃、培养体积90 mL(容量为500 mL的三角瓶装90 mL的培养液)、0.5％牛肉膏和2％大豆蛋白胨;优化后的相对酶活力达1 804.08 IU/mL.研究结果为进一步开发纳豆等保健食品提供理论基础.     

ERK1／2通路和血管内皮细胞在15-KETE诱导缺氧大鼠肺动脉收缩中的作用

目的用组织浴槽血管环技术研究细胞外信号调节激酶1／2（extracellularregulatedproteinkinasesl／2,ERKl／2）通路和血管内皮细胞在15-KETE诱导缺氧大鼠肺动脉收缩中的作用。方法16只体质量为（220±20）g清洁级Wistar大鼠随机分为2组（n=8）,正常对照组置于正常环境中饲养（FiO,=21％）,缺氧组置于缺氧的培养箱中饲养（FiO2：10％）,连续饲养9d后处死,游离直径约为0．5—1．0inIn肺内肺动脉（PA）。剪成3mm长的动脉环,在组织浴槽内进行张力研究。比较在15一KETE给药前后肺动脉环张力变化;机械法去除动脉环内皮,比较内皮完整和去内皮后,15一KETE对缺氧性肺动脉环的收缩作用;用ERKl／2上游激酶抑制剂U0126孵育肺动脉环,比较U0126孵育前后15-KETE对缺氧性肺动脉环的收缩作用;机械法去除动脉环内皮,再比较U0126孵育前后15-KETE对缺氧性肺动脉环的收缩作用。结果1）15-KETE对缺氧大鼠肺动脉环有收缩作用,呈浓度-效应关系,与正常对照组比较差异显著（P〈0．05）;2）内皮完整和内皮去除的肺动脉环,15-KETE对其缩血管作用均受到抑制,但差异显著（P〈0．05）;3）内皮完整肺动脉环,在U0126孵育前后,15-KETE的缩血管作用均受到抑制,但差异显著（P〈0．05）;4）内皮去除的肺动脉环,U0126孵育前后,15-KETE的缩血管作用也受到抑制,差异显著（P〈0．05）。结论15-KETE可浓度依赖性地收缩缺氧大鼠肺动脉环;15-KETE引起缺氧肺动脉收缩可能与ERK1／2信号转导通路和血管内皮细胞有关,并且位于平滑肌的ERKl／2通路也参与15-KETE诱导缺氧大鼠肺动脉环的收缩。     

补虚化瘀法对产后抑郁低雌激素大鼠海马RSK1和MEK1的影响

目的：探讨补虚化瘀方药参归仁合剂对产后抑郁大鼠海马神经元内胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)通路的影响,测定P90核糖体S6激酶（RSK1）和丝裂原活化细胞外调节激酶1(MEK1)蛋白表达量。方法：56只雌性大鼠分为正常组,模型组,参归仁高、中、低剂量组（7,3.6,1.8 g·kg-1·d-1）,盐酸舍曲林组（4.5 mg·kg-1·d-1）、苯甲酸雌二醇组（10 μg·d-1）,除正常组外,其余各组均采用苯甲酸雌二醇和黄体酮造模,模拟产后抑郁状态。使用蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测其海马P-RSK1和P-MEK1的蛋白表达量。结果：与模型组比较,参归仁中剂量组和舍曲林组在海马组织中P-RSK1蛋白表达水平明显增加（P＜0.01）;与模型组比较,参归仁中剂量组、舍曲林组和苯甲酸雌二醇组在海马组织中P-MEK1蛋白表达水平明显增加（P＜0.01）。结论：参归仁合剂可增加海马组织中P-RSK1和P-MEK1蛋白表达量,且参归仁中剂量组效果显著,参归仁合剂可起到抗抑郁作用。     

整合素连接激酶相关磷酸酶（ILKAP）抗体的制备及其特异性分析

以整合素连接激酶相关磷酸酶（ILKAP）全蛋白为抗原, 采用腿部肌肉注射和耳缘静脉注射相结合的方法对新西兰大白兔进行免疫, 共免疫6次, 最
终获得ILKAP抗血清. 采用Protein A agrose柱纯化抗体, 获得ILKAP的多克隆抗体. 免疫印迹分析表明, 所获得的ILKAP多克隆抗体具有较高的特异性, 间接ELISA方法测定ILKAP多克隆抗体的滴度为1 ∶1 600. 免疫荧光分析表明, 所获得的ILKAP多克隆抗体在细胞水平应用效果较好.     

乳腺癌特异性多肽介导生物大分子体内外效应

探讨乳腺癌特异性多肽PI携带外源性生物大分子靶向抗肿瘤的作用.将分离纯化获得的融合蛋白PI-EGFP与靶细胞MDA-MB-231体外共培养,探讨融合蛋白与靶细胞的结合能力;将此融合蛋白经尾静脉及肿瘤局部注射入荷瘤裸鼠体内,探讨其在肿瘤部位的聚集程度;利用分子克隆技术构建重组原核表达载体pET-28a(+)-pI-tk,诱导表达、分离纯化、鉴定获得的融合蛋白PI-HSV-TK,将不同浓度的融合蛋白与MDA-MB-231细胞共培养,经更昔洛韦(ganciclovir,GCV)作用后,探讨PI-HSV-tk对细胞的靶向杀伤效应.荧光显微镜下观察,在靶细胞内可检测到绿色荧光信号,经尾静脉及局部注射融合蛋白PI-EGFP后,在不同组织器官可见不同强度的荧光信号,在尾静脉注射组的肾脏和肿瘤部位可检测到荧光信号,而局部注射组仅在肿瘤部位可检测到;成功构建了重组原核表达载体pET-28a(+)-pI-tk;分离纯化获得高效表达的PI-TK融合蛋白,SDS-PAGE电泳及Western blotting鉴定融合蛋白的表达正确;CCK-8法及流式细胞仪检测显示,GCV对转导融合蛋白的MDA-MB-231细胞有杀伤作用,IC50值为152.64μg/mL.乳腺癌特异性转导多肽能携带生物大分子进入靶细胞,并携带具有杀伤效应的物质,使其发挥靶向治疗作用,为进一步探讨该多肽作为靶向性载体奠定实验基础和理论依据.