真菌纤维二糖水解酶基因的克隆与表达研究

采用能够转化细菌和真菌的双功能质粒ｐＤＬ１，与部分酶切的糙皮侧耳（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓｏｓｔｒｅａｔｕｓ）基因组ＤＮＡ片段进行体外重组。再用重组质粒ＤＮＡ转化玉米黑粉菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ，ｍａｙｄｉｓ）的原生质体，在平皿上筛选抗新霉素的转化子，转化率达８００转化子／μｇＤＮＡ，由此在玉米黑粉菌中建立了糙皮侧耳的基因文库。随机选出１５个转化子提取其ＤＮＡ，以３２Ｐ标记的ｎｅｕｒ基因酶切片段作为探针进行打点杂交，全部显示阳性，证明抗性菌落不是来源于敏感细胞的回复突变。以李氏木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）的纤维二糖水解酶（Ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒａｓｅｓ，简称ＣＢＨ）ＣＢＨⅡ基因末端片段为探针，从阳性克隆菌株中提取ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ转移并杂交，结果证明本研究已成功地克隆了糙皮侧耳纤维二糖水解酶ＣＢＨⅡ基因。基因的表达检测证明，克隆菌株具有纤维二糖水解酶活力。     

纤维素酶制剂中葡聚糖纤锥二糖水解酶活力的测定

根据真菌纤维素酶系中β-葡聚糖纤维二糖水解酶,内切β-葡聚糖酶以及纤维二糖酶在棉纤维上吸附和脱吸附性质的不同,拟订了一种可选择性地测定β-葡聚糖纤维二糖水解酶活力的方法。β-葡聚糖纤维二糖水解酶强烈吸附于棉纤维上,而且不为1 mol/L,pH4.8的醋酸缓冲液所洗脱;只有部分内切β-葡聚糖酶为棉纤维所吸附,但在上述条件下可完全被洗脱。纤维二糖酶不被吸附。在此基础上,再借助β-葡聚糖纤维二糖酶与内切β-葡聚糖酶的协同作用,可在后者过量存在的条件下,定量测定β-葡聚糖纤维二糖水解酶活力。用两种商品纤维素酶制剂验证了本方法的可靠性。     

海藻酸钠复合载体固定化细胞拆分D,L－泛解酸内酯的研究

研究了海藻酸钠及其与聚丙烯酰胺(PAM)和聚乙烯醇(PVA)的复合载体对镰孢霉菌(Fusarium oxysporum BU-11)细胞的固定，该固定化细胞被用于手性拆分D,L-泛解酸内酯的反应体系。实验表明，海藻酸钠固定化细胞具有较好的扩散性和强度，在水解试验中与游离细胞相比，酶活收率可达到80%以上，而且具有较好的温度和批次反应稳定性，在底物质量浓度为200 g/L的3L搅拌式反应器中6h水解反应20批,水解率可以保持在初始的80%左右。PVA和PAM的加入可增强固定化细胞的强度，前者对酶活影响不大，后者使酶活略有增加。     

诺卡氏菌催化环氧琥珀酸水解反应的影响因素

诺卡氏菌经超声波破碎后，环氧琥珀酸水解酶活性比完整细胞提高40倍以上，表明细胞通透性对酶的表现活性影响很大。用顺式环氧琥珀酸二钠溶液处理诺卡氏菌细胞，可使细胞的通透性提高，表观环氧琥珀酸水解酶活增大，转化反应时间缩短。底物不存在时，诺卡氏菌细胞的环氧琥珀酸水解酶在37℃不稳定，游离细胞的表观酶活半衰期为19min，破碎细胞酶活仅10．4min，表明内源蛋白酶是造成破碎细胞环氧琥珀酸水解酶不稳定的重要原因。完整诺卡氏菌细胞于37℃放置后再将细胞破碎，环氧琥珀酸水解酶的半衰期为144min，表明37℃放置后细胞通透性受到较大影响。存在底物时完整诺卡氏菌细胞于37℃放置后表现酶活基本不变。     

环糊精水解酶底物运输通道的动态结构分析

【目的】环糊精水解酶是作用于特殊底物的水解酶,可以水解圆锥形结构的底物。分析这个酶的底物通道为水解特殊结构底物提供研究基础。【方法】利用分子动力学模拟环糊精水解酶存在的底物通道,比较环糊精水解酶BsCMD_1J0H和TspCMD_1SMA在底物运输通道上的差异。【结果】BsCMD_1J0H和TspCMD_1SMA都为糖基水解酶家族13的蛋白质,它们的碳骨架基本吻合,而在α?螺旋分布上,TspCMD_1SMA相比于BsCMD_1J0H来说,螺旋结构更趋向于在蛋白质中心聚集。BsCMD_1J0H有6条底物通道连通蛋白质表面和活性中心,TspCMD_1SMA有8条底物通道连通。BsCMD_1J0H的底物通道平均半径为1,TspCMD_1SMA的底物通道平均半径为1.2。【结论】本研究提供了BsCMD_1J0H和TspCMD_1SMA两个蛋白质在和底物接触中的相关底物通道信息。     

环亚酰胺水解酶在大肠杆菌中的重组表达与纯化

以重组质粒pEI为模板,PCR扩增环亚酰胺酶基因序列,插入pMAL-s表达载体中.重组质粒转入E.Coli BL21(DE3)后,经IPTG诱导可溶性表达融合蛋白MBP-CIH,利用Amylose亲和柱一步纯化获得MBP-CIH,再经人鼻病毒3C蛋白酶切除亲和臂MBP,硫酸铵沉淀、Phenyl-Sepharose疏水层析获得电泳纯的CIH,纯化倍数为12.7,活力回收29%,比活为36.3 U/mg.重组环亚酰胺水解酶的最适pH为8.0～9.0,最适温度50 ℃,在温度低于55 ℃时酶的性质相对稳定.Ni2 、Co2 能显著提高酶活力,Mn2 、Ca2 和Mg2 对酶活没明显有影响,Cu2 、Zn2 、Cd2 、Fe2 以及金属螯合剂8-羟基喹啉、EDTA则对酶有不同程度的抑制作用.初步说明该酶是一个金属依赖性酶.     

苯并氮杂冠醚-15-冠-5 Schiff碱钴(Ⅱ)配合物催化PNPP水解研究

在pH7.0和25 ℃下,研究了三种带有苯并氮杂冠醚-15-冠-5侧基的Schiff碱钴(Ⅱ)配合物CoL1,CoL2和CoL3,作为模拟水解金属酶催化羧酸酯水解的作用.通过对水解反应体系的特性吸收光谱的分析,提出了PNPP的催化水解的机理,并在此机理上建立了PNPP催化水解的动力学数学模型.讨论了三种Co(Ⅱ)配合物催化水解PNPP的性能.     

二氧环胺类Zn(Ⅱ)配合物模拟碳酸酐水解酶CA的研究

研究了二氧环胺类Ｚｎ（Ⅱ）配合物对ＰＮＰＰ水解的影响,用动力学方法解析了ＰＮＰＰ水解的二级速率常数及二氧环胺类Ｚｎ（Ⅱ）配合物中配位水的解离常数Ｋａ,结果表明,该配合物对ＰＮＰＰ水解反应有显著的催化作用,并提出了反应催化的机理,说明了该类配合物是一个较好的碳酸酐水解酶ＣＡ的模拟物。     

Schiff碱钴(Ⅱ)配合物催化PNPP水解研究

在pH7.0～8.2和25℃下, 用分光光度法研究了两种带冠醚环或吗啉环的Schiff碱钴(Ⅱ)配合物CoL1和CoL2,作为模拟水解金属酶,对羧酸酯水解的催化作用.通过对水解反应体系的特性吸收光谱的分析,提出了PNPP的催化水解的机理,并在此机理上建立了PNPP催化水解的动力学数学模型.讨论了两种Co(Ⅱ)配合物催化水解PNPP的性能,动力学和反应机理.     

萝卜贮藏期间蛋白水解酶及磷酸酶同工酶谱研究

用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法分离在不同贮藏期三个品种的萝卜块根的蛋白水解酶及磷酸酶后 ,用特异染色方法检测酶活性及同工酶谱变化 ,实验结果表明 :在不同贮藏期的同一品种萝卜及同一贮藏期的不同品种萝卜之间蛋白水解酶同工酶谱变化较大 ,最适pH均为 7.0 ;酸性磷酸酶同工酶谱也有较大变化 ,碱性磷酸酶谱缺失。萝卜贮藏期存在活跃的蛋白水解酶及磷酸酶的活动。