铬酵母制备及在酸奶中的添加

利用生物合成法制备了有机铬含量较高的新型添加剂——铬酵母，并将其添加到酸奶中．用分光光度法对铬酵母及添加了铬酵母的酸奶进行了总铬和有机铬含量的测定，考察了样品处理方法，并从酸奶的感官鉴评、酸度及有机铬含量方面考察铬酵母的添加对酸奶品质的影响．结果表明，铬酵母的添加对酸奶品质无任何不良影响，而有机化程度在发酵前后也无明显的变化．     

毕赤酵母发酵生产重组人血清白蛋白高密度培养条件的研究

研究了毕赤酵母基因工程菌高密度培养条件。在全合成培养基的基础上考察了诱导过程中添加(NH₄)₂SO₄、微量元素PTM₁、油酸、甲醇加量及pH等因素对重组人血清白蛋白表达的影响，发现PTM₁能显著提高白蛋白的表达，6mL/L时蛋白表达量最大。诱导期硫酸铵浓度维持在 3g/L左右蛋白表达量最大，高于3g/L抑制蛋白表达。酸性环境不利于蛋白表达，诱导过程维持pH6.0～6.5最佳。甲醇最佳诱导浓度为10mL/L。添加0.05%的油酸可有效提高蛋白表达。可以此作为发酵罐上发酵培养流加成分的参考。     

糖蜜发酵培养高铁营养酵母

采用生长周期短，易于工业化生产的酵母为菌株，以糖蜜为主要培养基，通过现代发酵工程技术，在3m^3发酵罐上进行中间试验，在12m^3发酵罐上试生产高铁营养酵母．其发酵产品高铁营养酵母铁的含量为1061mg／kg，高铁营养酵母的产率为2．54％，蛋白质的含量(质量分数)为51.90％.     

6个植物MARs序列的ARS功能鉴定与分析

利用酵母表达系统, 对来自烟草和拟南芥的6个植物MARs序列分别进行了ARS功能鉴定. 结果表明, 在酵母细胞内, TM1和AM4有强的自主复制功能, 其活性与来自酵母染色体的ARS相当, 其他4个植物MARs序列无ARS活性. 为了进一步分析植物MAR序列中ARS的活性区, 利用PCR方法对TM1和AM4进行亚克隆, 相应的亚克隆分别命名为TM1-1, TM1-2, TM1-3, AM4-1, AM4-2和AM4-3. 实验发现, TM1-3和AM4-3不仅具有比完整MARs更高的ARS活性, 而且在酵母转化效率、转化稳定性及生长速度方面也优于完整片段. 本研究结果为阐明MAR的作用机制与自主复制功能的关系提供了重要线索.     

腺病毒5型E1A在毕赤酵母中的表达及对肿瘤细胞生长的抑制作用

腺病毒5型E1A(Ad5E1A)作为一个抑癌基因, 由于具有较强抑癌作用及显著的化放疗增敏作用而受到人们的关注. 但由于它能整合到宿主细胞基因组中长期表达, 并能使Rb基因失活, 使动物细胞永生化等而引起人们的担心. 为了避免E1A在基因治疗中存在的问题, 设想以E1A蛋白进行探索. 首先构建了E1A真核表达载体(pPIC9/E1A), 转化毕赤酵母(GS115), 筛选高表达重组菌株. 经摇瓶试验, 甲醇诱导表达3 d后, 分泌型的E1A蛋白经HiTrap Q 和HiTrap SP两步柱层析, 获得了较高纯度的E1A蛋白, 并经SDS-PAGE 和Western blot 鉴定. E1A蛋白经Chariot介导能顺利进入细胞, 并大部分定位在细胞核, 使LN686细胞发生明显的G2/M期阻滞, 体外能显著抑制LN686肿瘤细胞生长. 为利用E1A蛋白在肿瘤治疗中应用的可能性提供了实验依据.     

腺病毒5型E1A在毕赤酵母中的表达及对肿瘤细胞生长的抑制作用

腺病毒5型E1A(Ad5E1A)作为一个抑癌基因, 由于具有较强抑癌作用及显著的化放疗增敏作用而受到人们的关注. 但由于它能整合到宿主细胞基因组中长期表达, 并能使Rb基因失活, 使动物细胞永生化等而引起人们的担心. 为了避免E1A在基因治疗中存在的问题, 设想以E1A蛋白进行探索. 首先构建了E1A真核表达载体(pPIC9/E1A), 转化毕赤酵母(GS115), 筛选高表达重组菌株. 经摇瓶试验, 甲醇诱导表达3 d后, 分泌型的E1A蛋白经HiTrap Q 和HiTrap SP两步柱层析, 获得了较高纯度的E1A蛋白, 并经SDS-PAGE 和Western blot 鉴定. E1A蛋白经Chariot介导能顺利进入细胞, 并大部分定位在细胞核, 使LN686细胞发生明显的G2/M期阻滞, 体外能显著抑制LN686肿瘤细胞生长. 为利用E1A蛋白在肿瘤治疗中应用的可能性提供了实验依据.     

单链莫奈林基因表达载体的构建及其分泌表达

根据甜蛋白莫奈林的氨基酸序列，选择酵母偏爱密码子，化学合成单链莫奈林(Single-Chain Monellin，SCM)基因片段，并拼接成全基因．基因的DNA序列分析表明，合成的单链莫奈林基因与设计的一致．该基因插入于毕赤氏酵母整合型质粒pPIC9K中置于AOXI启动子的控制下，并通过电转化技术将重组质粒pPIC9K／SCM导入Pichia pastoris，在含有G418的YEPD平板上筛选整合型的多拷贝的转化子．转化子在BMMY培养基中经甲醇诱导表达，用SDS-PAGE检测发酵液，表明SCM的分泌表达蛋白可达发酵液蛋白含量的90％．     

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的分离纯化

报道了葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的分离纯化. 在0.1 mol/L的碳酸氢钠溶液中,以溶胀法从酵母中提取胞内酶.粗抽提液经过60 %～75 % 饱和度的硫酸铵盐析, Sephadex G-100凝胶柱层析.葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的收得率为12.4%,纯化倍数达51.2.     

利用毕赤酵母表达植物甜蛋白（brazzein）的初步研究

实验将含有Brazzein基因的pPIC9K穿梭质粒通过电导入巴斯德比赤酵母（Pichia pastori）GS115中，并从22个阳性克隆中筛选出His^＋Mut^s高拷贝转化子2个，经诱导表达，产物进行Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定，目标蛋白的相对分子量与理论值一致，又经小试（5～10L罐）蛋白产量可达385mg/L。利用大孔树脂D152初步分离，得到有微甜味的产物。进一步纯化后获得了¹D-NMR图谱。     

酵母细胞流加培养过程的建模与预估控制

建立了包括菌体浓度 X、底物浓度 S、培养液体积 V为状态变量的酵母流加发酵过程的非结构动力学模型 ;基于该模型 ,提出了一种克服被估变量的累积误差的一步预估方法 ,用以估计难以可在线测量的菌体浓度、底物浓度等生化状态变量 ,并根据预估结果 ,进行流加操作。该方法应用于酵母流加培养 ,酵母对糖得率由 35 .1%提高到 40 .2 %。