长型肌球蛋白轻链激酶4Ig结构域的表达及单克隆抗体的制备

长型肌球蛋白轻链激酶(long myosin light chain kinase,L-MLCK)及其分子内结构域的功能还不清楚.在研究其功能时,特异性抗体是一基本工具,但目前国际上还没有制备成功特异性较好的抗体.为此,我们先在大肠杆菌E.coliBL21中重组表达了鸡L-MLCK的4Ig蛋白片段(MLCK4Ig),蛋白经纯化后作为抗原免疫小鼠.在小鼠血清中检测到特异性抗体的基础上,建立了2株杂交瘤细胞株,获得抗鸡MLCK4Ig的单克隆抗体.该抗体可以特异与鸡L-MLCK和鸡MLCK4Ig反应.本文并对该抗体的特性及应用进行了讨论.结果表明,我们部分解决了L-MLCK的抗体缺乏问题,为研究L-MLCK及MLCK4Ig片段的功能提供了重要工具.     

人基因组中表达序列的分离

迅速分离和鉴定大片段基因组DNA中的表达序列,可加速人类疾病相关基因的克隆和人类基因转录图的构建.本文对几种常用的分离表达序列的方法,就其可行性、应用前景和面临的问题展开讨论.     

基因组整合与游离质粒联合应用介导阿魏酸酯酶A在马克斯克鲁维酵母中高效分泌表达

阿魏酸是植物中广泛存在的酚类化学物质,具有抗氧化活性.阿魏酸酯酶能够水解植物细胞壁半纤维素和阿魏酸之间的酯键,释放阿魏酸,在食品、医药、饲料加工等领域具有广泛的应用价值.马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)是一种生长迅速、蛋白分泌能力强的新型食品安全级酵母,具有高效分泌表达菊粉酶的能力,本研究利用基因组菊粉酶位点INU1整合与游离质粒联合应用的方式,在马克斯克鲁维酵母中实现了黑曲霉(Aspergillus niger)阿魏酸酯酶AnFaeA的高效表达,发酵液上清中的酶活达到164.4U/mL.利用马克斯克鲁维酵母重组表达的阿魏酸酯酶能够高效降解玉米芯释放阿魏酸,释放量可达1.81mg/g,并且在β-木聚糖酶的协助下可进一步提高阿魏酸的释放量,达到2.8mg/g.     

梗死后大鼠缺血心肌基因差异表达谱构建

为寻找梗死后大鼠缺血心肌差异表达基因, 采用结扎Wistar大鼠冠状动脉左前降支的方法, 建立急性心肌梗死(AMI)模型, 饲养7 d后处死大鼠, 提取正常和缺血心肌总RNA, 应用长标签基因表达系列分析(long serial analysis of gene expression, LongSAGE)构建AMI后大鼠缺血心肌基因差异表达谱, 荧光定量PCR鉴定部分差异基因的表达. 结果显示, 在建立的AMI后缺血心肌和正常心肌组织LongSAGE标签库中, 共获得标签15966个, 正常心肌获得9646个, 梗死后缺血心肌获得9563个. 通过NCBI网站BLAST同源性分析后, 发现新核苷酸序列标签7665个. 与正常组比较, 142个基因在AMI大鼠心肌组织中的表达有显著性差异(P < 0.05), 这些差异基因主要与氧化磷酸化、三磷酸腺苷(ATP)合成、糖异生等能量代谢通路相关. 荧光定量PCR的鉴定结果与LongSAGE差异表达结果基本一致. 结果表明, AMI可引起多基因表达异常, 能量代谢作用通路相关基因的异常表达是造成AMI后心肌损伤的重要分子机制.     

基于分层的平衡迭代规约聚类分析算法研究

详细分析讨论了BIRCH算法中存在的不足,并针对其不足进行一定的改进,提出了一种基于离差平方和的改进多闻值BIRCH算法,充分利用离差平方和来建立簇与簇的相关性,相对于单纯以簇之间的中心距离来建立相关性有一定的改进,同时在分裂因子的确定上采用了簇中直径的最大值,克服因采用经验值确定分裂因子的缺陷.最后,引入到基因序列图形表达数据聚类分析应用中.     

HIV-1复合多表位基因的原核表达和多克隆抗体制备

为表达HIV-1复合多表位基因并制备其多克隆抗体.设计引物,以HIV-1标准株全长cDNA序列为模板,PCR扩增获得p24基因片段;合成改造后的多个表位基因MEG并且与p24片段相连接,克隆入大肠杆菌.将测序正确的p24MEG基因克隆入原核表达载体pET32a并诱导表达.采用Ni2 -NTA亲和柱纯化目的蛋白,以p24抗体对纯化蛋白进行Western-blot分析.将纯化的融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体.通过PCR成功获得长度为651 bp的HIV-1的p24片段,获得了与多表位基因连接后的p24MEG基因,通过诱导表达,显示在相对分子量约45 000处有预计大小的特异性条带,表明成功表达出融合蛋白.经此纯化的融合蛋白免疫的家兔能产生特异性抗体,其滴度达到1:3 200.纯化的融合蛋白和多克隆抗体为研究新型HIV疫苗奠定一定的理论和实践基础.     

TePPO基因克隆及表达分析

万寿菊(Tagetes erecta L.)作为一种兼具观赏和经济价值的优质植物资源,在世界范围内广泛种植.文章依据万寿菊转录组数据,通过RNA提取、反转录克隆了万寿菊原卟啉原氧化酶(Tagetes erecta protopor-phyrinogen oxidase,TePPO)基因.PPO作为催化叶绿素合成的关键酶...     

番茄SlIWS1基因植物表达载体构建与瞬时表达

番茄是广泛种植的果蔬类作物,病害发生是导致番茄产量和品质降低的重要原因,AtIWS1 (Arabidopsis thaliana interact with SPT6)基因可以提高拟南芥抗病性.文章通过病原菌接种克隆番茄SlIWS1基因,并构建植物表达载体,利用农杆菌介导方法在烟草叶片中进行瞬时表达和Western B...     

乳腺癌脑转移差异表达基因的生物学功能分析

乳腺癌脑转移(breast cancer brain metastasis,BCBM)的发病机制尚未明确。为了探究BCBM的发病机制,对BCBM差异表达基因的生物学功能进行研究并筛选关键调控基因。从基因表达综合数据库(gene expression omnibus,GEO)下载4个BCBM基因表达谱数据(GSE12237、GSE100534、GSE125989以及GSE43837),采用R语言筛选差异表达基因,采用富集分析包括基因本体分析(gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书分析(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)进行生物学功能分析,采用STRING和Cytoscape分析蛋白质相互作用网络,采用Kaplan-Meier进行生存分析。结果表明,同时存在于2个及以上基因表达谱数据中的差异表达基因261个,GO分析主要涉及细胞外基质组织、细胞外结构组织等生物过程,细胞外基质结构组成、胶原结合等分子功能,含有胶原的细胞外基质、胶原蛋白三聚物等细胞组分;KEGG分析主要涉及蛋白质消化和吸收、局部黏附等通路。蛋白质相互作用网络分析得到9个关键调控基因,其中,DCN、COL6A1与BCBM的生存率显著相关,可作为潜在的BCBM关键调控基因,并为BCBM分子机制的研究提供思路。     

红霉素抗性基因ermE在链霉菌中的表达及抗性测定

红霉素抗性基因ermE编码一种甲基化酶,可以对50S核糖体亚基上的23SrRNA进行甲基化修饰．甲基化作用可能引起核糖体构型变化,阻碍红霉素与50S核糖体亚基的结合,从而使宿主获得抗性．研究中将来自红色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea）的ermE基因克隆到链霉菌高拷贝表达栽体pUWL201和plJ6021上组成型启动子ermEp＊和硫链丝菌素诱导型启动子PfipA的下游,构建出了链霉菌表达质粒pKIM4,pKIM7和pKIM8．将pKIM4,pKIM7和pKIM8分别转入S．lividans链霉菌中,每种转化子都能表现出明显的红霉素抗性,并且ermE基因在TK64／pKIM8转化子中还实现了高效表达．