瑞氏木霉过量表达重组蛋白的机制、表达调控及应用研究进展

丝状真菌瑞氏木霉(Trichoderma reesei)具有很强的分泌纤维素酶的能力.近年来,利用基因工程的手段对瑞氏木霉进行遗传改造,构建高效表达载体,产生具有新性状的重组菌株,用以过量表达同源和异源蛋白的研究取得了新的进展.本文就在瑞氏木霉分泌重组蛋白的机理、表达调控及应用等研究方面的分子生物学最新进展作一综述.     

去甲肾上腺素对不同初始表达水平α1B-肾上腺素受体表达的调节

选用α_1B-肾上腺素受体(α_1B-AR)密度分别为(6 336 913)和(773 164) fmol? mg^-1 的两株克隆HEK293 细胞, 分别用高表达和低表达α_1B-AR 表示, 比较去甲肾上腺素(NE)持续作用下不同初始表达水平的α_1B-AR 发生密度改变的差别. 结果显示10 mmol? L^-1 NE 持续作用48 h 可使高表达α_1B-AR 的密度发生下调, 却可使低表达α_1B-AR 的密度发生上调. 蛋白激酶C(PKC)抑制剂RO- 31-8220 或Calphostin C 可消除NE 对高表达α_1B-AR 的下调作用, 但对低表达α_1B-AR 的密度上调无影响. PKC 激动剂PMA 不仅可模拟NE 对高表达α_1B-AR 的下调作用, 而且使低表达α_1B-AR 的密度也发生下调. 肌浆网/内质网钙泵抑制剂CPA 和内钙螯合剂BAPTA-AM 不影响NE 对高表达α_1B-AR 的下调作用, 但可部分抑制低表达α_1B-AR 的上调. 以上结果提示, NE 持续作用可对初始表达水平不同的α_1B-AR 密度产生不同方向的调节作用, 作用机制亦不尽相同.     

纤溶酶原激活因子和抑制因子在早期胎盘中的表达及其功能

用原位杂交方法研究了人早期胎盘中组织型（ｔ）和尿激酶型（ｕ）纤溶酶原激活因子（ＰＡ）与其相应的抑制因子１型（ＰＡＩ－１）和２型（ＰＡＩ－２）ｍＲＮＡ的分布。结果表明：（１）在绒毛和蜕膜的血管壁,Ｒｏｈｒｓ和Ｎｉｔａｂｕｃｈ纹间的蜕膜中的大部分外细胞滋养层细胞沿绒毛盘、基底盘、绒毛叶间隔和绒毛膜的细胞滋养层细胞以及蜕膜的腺体细胞中都检测到ｔＰＡ、ｕＰＡ、ＰＡＩ－１和ＰＡＩ－２ｍＲＮＡ;（２）在基底绒     

人类肽-甲硫氨酸亚砜还原酶的cDNA克隆、组织表达谱特征及染色体定位

蛋白质结构中某些氨基酸的氧化和还原是生物体内对蛋白功能的一种调控方式．甲硫氨酸（Ｍｅｔ）被氧化则变为甲硫氨酸亚砜（Ｍｅｔ（Ｏ））,它可导致所在蛋白质的生物学活性降低或丧失,但肽－甲硫氨酸亚砚还原酶（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ, ｍｓｒＡ）则可使甲硫氨酸亚砜还原为甲硫氨酸,使其所在蛋白质重新恢复活性．为了研究人体中Ｍｅｔ氧化还原的机制,以牛ｍｓｒＡ ｃＤＮＡ序列为信息探针,筛选人ＥＳＴ数据库,依据若干同源ＥＳＴ的信息从人ｃＤＮＡ分子库中克隆到一个长１２５５ｈｐ的人ＭＳＲＡ ｃＤＮＡ．该ＣＤＮＡ包含一个长７０５ ｂｐ的可读框,它编码了 ２３５个氨基酸残基．同源性比较表明,该基因与牛和大肠杆菌的ｍｓｒＡ基因的氨基酸一致性分别为８８％和６１％．表达谱分析发现,该基因在人体大多数组织中均有一条长约１．６ｋｂ的转录本,并在肾中呈高表达．应用辐射杂种细胞株定位系统（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄ ｍａｐｐｉｎｇ ｐａｎｅｌ, ＲＨ ｍａｐｐｉｎｇ）将该基因精确定位在人染色体８ｐ２２～２３区带的ＤＳＳ５１８和Ｄ８５５５０位标之间,由于此前已有Ｋｅｒａｔｏｌｙｔｉｃｗｉｎｔｅｒｅｒｙｔｈ     

鲁迅文学作品表达机制研究——以《故事新编》为例

作为中国现代史上最伟大的文学家之一,鲁迅之所以能够创作出大量深刻且典型的文学作品,塑造出不朽的文学艺术形象,和其独特的表达机制具有很大关系。特别是在《故事新编》当中,鲁迅引用了一些中国古老的神话故事和历史传说,体现了大量的中国传统文化元素。但在表达方面,整体上却十分隐晦,很难从字面意思上直接了解其创作情感和意图,必须经过深入分析研究之后,才能得到深刻的感悟和理解。为此,以《故事新编》为例,从现实与文本关系、叙事方法等方面着手,对其表达机制进行分析,以此获得鲁迅文学作品中的特色内涵,明确传统文化在新历史时期的重要价值和发展方向。     

酯酶基因Est2的异源表达及酶学性质研究

对来自α/β水解酶超家族的酯酶基因Est2进行了克隆、异源表达及纯化,然后对其酶学性质进行了研究.研究结果显示:酯酶Est2的最适底物为对硝基苯乙酸酯(p-NPC2),最适反应温度为50℃,最适pH为8.0;Est2具有较好的pH稳定性,在pH 5.0～10.0范围内,其相对酶活性保持在50％以上;在40℃条件下具有最...     

密码子优化的植酸酶基因appA-P在毕赤酵母中的高效表达

根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子使用偏爱性,对Escherichia coli来源的高比活植酸酶基因(appA)全面地进行密码子优化,人工合成了植酸酶基因(appA-P),并将该基因克隆到毕赤酵母诱导型分泌表达载体pHBM905A上,获得重组质粒pHBM905A-appA-P,通过PEG1000转化法将线性化的重组质粒转化毕赤酵母GS115菌株,筛选得到一个高效表达植酸酶的重组菌株GS115-appA-P,在25℃摇瓶培养168 h后酶活力达到422 U/mL,该植酸酶最适反应温度为60℃,最适反应pH为4.5,在20~50℃、pH1.0~6.0范围内较稳定.     

用于蛋白亚细胞定位研究的烟草愈伤组织培养条件优化

使用绿色荧光蛋白作为报告基因来研究目的蛋白的亚细胞定位得到广泛应用.使用稳定表达系统研究蛋白的亚细胞定位比较耗时,但可以先选择愈伤组织进行观察以确保构建的载体能够表达.优化了愈伤组织的培养条件,得到了质地疏松柔软的白色愈伤,不受叶绿体的荧光干扰,便于进行荧光观察.     

人胰高血糖素样肽-1串联体的克隆及其表达

为大量获取人胰高血糖素样肽-1,利用基因串联的方法构建了人胰高血糖素样肽-1的一组串联体.将化学合成的人胰高血糖素样肽-1（human glucagon like peptide-1, hGLP-1）cDNA基因插入质粒载体pET-32a(⁺)中,构建成硫氧还蛋白（thioredoxin）及六聚组氨酸（hexahistidine）与rhGLP-1的融合表达载体pET32-GLP-1.在此基础上将该融合基因序列进行同向串联,获得二串和三串的表达载体pET32-GLP-1-2 和pET32-GLP-1-3.将该三种表达载体转化大肠杆菌BLR(DE3)后获得相应的基因工程菌.结果表明：三种基因工程菌经发酵和IPTG诱导后均正确表达目的蛋白,目的蛋白表达量随着基因串数的增加而得到一定提高,重组蛋白经分离纯化后进行生物学活性测试具有明显的降低血糖浓度作用.     

蜘蛛拖牵丝蛋白基因转家蚕表达质粒的构建

利用DNA重组技术对络新妇蛛(Nephila clavipes)拖牵丝蛋白基因MaSp1高度重复序列进行多次重组,人工构建成1.6 kb的蜘蛛拖牵丝蛋白人工基因Sil-E,DNA序列分析证明了人工基因序列的正确性.将家蚕L链基因启动子片段、L链cDNA、L链基因终止子融合在一起,构建成丝腺特异性表达单元.再与Sil-E融合构建成蜘蛛拖牵丝蛋白基因家蚕丝腺特异表达单元.将该表达单元克隆到转座子piggyBac的转基因载体中,获得了蜘蛛拖牵丝蛋白转基因表达载体.采用显微注射法将其与辅助质粒共导入到家蚕蚕卵中.筛选转基因阳性个体,经PCR和Southern杂交鉴定,结果表明目的基因整合到家蚕基因组中,为进一步研究家蚕作为生物反应器表达蜘蛛拖牵丝蛋白基因奠定了基础.