绿色糖单孢菌麦芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达

【目的】构建高产麦芽糖α-淀粉酶的工程菌株并实现高效分泌表达。【方法】PCR扩增麦芽糖α-淀粉酶基因sva,再与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌麦芽糖诱导型穿梭载体pHCMCO4-Pglv连接,构建重组质粒pHCMCO4-Pglv-sva并转入枯草芽孢杆菌进行表达,对重组酶进行SDS-PAGE分析,然后对重组菌株的生长及发酵条件进行优化。【结果】成功构建重组质粒pHCMCO4-Pglv-sva并在枯草芽孢杆菌中实现分泌表达,SDS-PAGE分析发现,在55kDa处得到特异性蛋白条带。单因素试验结果显示,重组菌的最适诱导温度为35℃,最适接种量为4%(V/V),最适装液量为30mL。正交实验结果显示,重组菌的最佳发酵条件组合是诱导温度37℃、接种量5%(V/V)、装液量25mL,在此条件下发酵液粗酶活力达到257.3698U/mL。装液量对重组菌的产酶量影响显著。【结论】成功构建能高效分泌表达麦芽糖α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌株,经发酵条件优化后,重组酶产量显著提高10倍左右。     

两歧双歧杆菌抗福氏痢疾杆菌感染的机制研究

目的：以福氏痢疾杆菌感染大鼠为模型,研究两歧双歧杆菌对福氏痢疾杆菌感染大鼠肿癌坏死因子-α（TNF-α）水平的影响,从而探讨其抗福氏痢疾杆菌感染的机制。方法：先用硫酸链霉素给正常大鼠灌胃,出现菌群失调症状,再通过福氏痢疾杆菌灌胃感染大鼠,使用两歧双歧杆菌液干预治疗福氏痢疾杆菌感染大鼠,检测干预治疗后各组大鼠血及脾中TNF-α的含量。结果：福氏痢疾杆菌感染各组与正常组相比,大鼠体内血及脾中TNF-α的含量均有明显差异;福氏痢疾杆菌感染各组中,未干预组、生理盐水组及双歧杆菌组脾中TNF-α的含量有显著变化。其中,双歧杆菌组的TNF-α水平升高更明显。结论：两歧双歧杆菌对福氏痢疾杆菌感染机体的TNF-α分泌有一定促进作用,是其抗福氏痢疾杆菌感染的可能机制。     

双歧杆菌的分离与培养

利用大多数双歧杆菌具有半乳糖苷酶且活性较高的特性.在改良的MRS培养基中加入X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷)作为显色底物.产生颜色反应,进而从市售酸奶中分离出3株双歧杆菌, 并对其中的1 株进行生长曲线的绘制及培养基成分的优化, 为今后双歧杆菌产品的开发及生物学功能的探索奠定基础.     

产氢红杆菌类胡萝卜素代谢研究

在不损伤细胞条件下,采用分光光度法探求了产氢红杆菌(Rhod obacter sp.)R 7菌株光合色素合成规律,研究了供氢体、氮源和生长因子对R 7菌株细胞生长、类胡萝卜素表达和合成量的影响.结果表明,光合色素的合成具有时序性,R 7菌株首先合成可吸收近红外光的细菌叶绿素,而370 nm和590 nm组分的细菌叶绿素的合成则晚于类胡萝卜素,426 nm类胡萝卜素含量的变化引起捕光色素复合体和光反应中心复合体比率的改变.与乙酸钠相比,苹果酸钠只在生长初期对细胞生长有促进作用,但最终细胞生物量无明显差异.在乙酸钠体系中,分别用酵母提取物和谷氨酸钠替代生物素和硫酸铵后可使细胞生物量提高37.9%和20.4%.乙酸钠供氢体可诱导细胞进行球形烯和球状菌素类胡萝卜素代谢,苹果酸钠和谷氨酸钠有利于426 nm类胡萝卜素组分的产生,但不利于450 nm类胡萝卜素组分的积累,苹果酸钠还可诱导产生556 nm类胡萝卜素新组分.酵母提取物可显著提高类胡萝卜素产量,并改变了类胡萝卜素合成途径.     

苏云金芽孢杆菌aiiA基因载体构建及石斛兰转化

细菌性软腐病是石斛兰及其它兰花栽培和生产中的一大危害.苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)中含有aiiA基因,该基因转入一些植物可赋予植物表现出软腐病抗性.从Bt菌中克隆出aiiA基因,并装载入植物表达载体pCAMBIA1301,构建出可用于转入石斛兰的pSAN载体;首次利用根癌农杆菌EHA105将pSAN载体转入石斛兰,并获得潮霉素抗性苗.这些抗性苗经GUS组织化学染色和PCR检测证实为转基因苗, 这将为获得具有软腐病抗性的石斛兰品种打下基础.     

利用芽孢杆菌混合菌群发酵生产生物有机肥的研究

以斯太贝亚叶面肥分离得到的4株芽孢杆菌(巨大芽孢杆菌M3,Bacillus oleronius O4,枯草芽孢杆菌S10,解淀粉芽孢杆菌A8)为起点,研究和改造斯太贝亚叶面肥.采用琼脂块法及钼锑抗比色法,考察4株芽孢杆菌及混合菌群在抑制植物病原真菌及降解土壤中难利用磷的情况.结果表明,混合菌群抑菌性能较其他菌株强,对梨青霉病菌的抑制率高达75.8%;混合菌群与巨大芽孢杆菌M3对土壤中难利用磷降解情况相差不大,均比其他菌株降解性强.由于斯太贝亚叶面肥含化学成分,对人体及环境会造成一定负担,故以天然无化学成分且有机质含量高的小麦秸秆为原料发酵生物有机肥,发酵后添加聚γ谷氨酸.考察生物有机肥对黄瓜幼苗感染植物病原真菌防治效果及病情指数,并考察生物有机肥对毛豆幼苗各项生长指标的影响.结果表明,研制的生物有机肥能够显著降低黄瓜幼苗感染植物病原真菌的病情指数,防治效果达55.56%;并且能够一定程度提高毛豆幼苗的株高、地上部鲜重、地上部干重.     

酸碱度和铁离子对毒砂生物氧化作用的影响研究

毒砂的氧化作用会产生富含As的酸性矿山废水(AMD)引起了广泛关注,但p H和Fe2+离子对毒砂生物氧化作用的影响还不清楚。利用从大宝山AMD培养得到的氧化亚铁硫杆菌(A.f.)和毒砂进行初始p H2.00、p H3.00和p H3.50为期30 d的不含Fe培养基有菌氧化、含Fe培养基无菌氧化和含Fe培养基有菌氧化实验,通过测定实验过程溶液的总As离子、Fe2+含量和p H值,获得如下结论:1不含Fe培养基有菌氧化过程,初始p H越低,实验结果溶液As离子质量浓度越高,初始p H2.00比初始p H3.50的溶液中As离子质量浓度要高大约15倍,即低p H可促进毒砂的微生物氧化作用。2含Fe培养基会使毒砂生物氧化过程p H保持在4.0以下进行,促进毒砂氧化,提高释放的As离子质量浓度。在AMD中加入一定的碱性物质来提到p H值,可降低Fe2+质量浓度,抑制毒砂的生物氧化作用,降低As离子的含量。     

一株具有羽毛降解活性的益生菌的筛选和应用

利用以羽毛为唯一碳氮源的培养基,从市售的益生菌中分离筛选可高效降解羽毛的菌株,发现菌株HUBM2摇瓶培养7d,可将大部分的羽毛降解.该菌株经16SrDNA测序鉴定是地农芽孢杆菌.为缩短降解周期,利用该菌研究不同羽毛预处理方法对羽毛降解效率的影响,发现用0.02％的NaOH溶液处理15 min的羽毛降解效率最高.用稀碱处理的羽毛为唯一碳氮源,从接种量、培养基2个方面对HUBM2降解羽毛的条件进行优化,经过优化后,羽毛降解周期从7d减少到2d,羽毛降解率达到80％.测定降解产物中小肽和益生菌的含量,结果显示,发酵液中益生菌含量为1.4×109 CFU/mL,小肽和氨基酸含量为0.41 mg/mL.     

枯草芽孢杆菌B29菌株对黄瓜植株的诱导抗性

对枯草芽孢杆菌B29菌株诱导黄瓜根系相关防御反应酶活性的变化趋势进行了研究,结果表明该菌株接种能够诱导黄瓜根系苯丙氨酸解胺酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）活性有不同程度的提高,尤其在挑战接种病原菌后,3种防御反应酶活性上升的幅度比单独接种要高,说明挑战接种有利于诱导抗性的表达。结合枯草芽孢杆菌B29菌株对黄瓜枯萎病的田间防效试验,可以说明诱导抗性是其生防作用机制之一。     

采用钠盐调酸发酵生产D-乳酸的工艺研究

对芽孢乳杆菌CASD采用钠盐调酸发酵生产D-乳酸的工艺进行了探索.以廉价花生粕为唯一氮源,采用氢氧化钠为中和剂,D-乳酸的发酵质量浓度达到118.2g/L,糖酸转化率为89.1%,光学纯度达到99.3%,满足乳酸聚合要求.钠盐调酸适用于电渗析分离纯化乳酸工艺,该研究为开发新型的连续发酵-分离耦合生产D-乳酸工艺提供了技术基础.