冷活性琥珀酸脱氢酶的特性

用常规酶学方法从嗜冷酵母(Y18)中分离纯化有催化活性的琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase, SDH).该酶的最适反应温度为20℃,0℃仍然保持酶活性的20%,40℃处理30min酶活性损失90.4%,不同温度处理后酶在280nm的紫外吸收明显改变,随温度升高在280nm紫外吸收值增大.这些结果表明所分离到的SDH是对温度敏感的冷活性酶.纯化的SDH经PAGE电泳分析显示单一条带,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测出相对分子质量为60×103和32×103的2条带,分别为黄素蛋白(flavoprotein, FP)大亚基和铁蛋白(iron-protein, IP)小亚基.通过对FP的1491个碱基的DNA序列分析表明(酿酒酵母FP基因全序列由1923个碱基组成),菌株Y18与酿酒酵母具有很高的DNA序列同源性;Y18与酿酒酵母FP一级结构包括酶的活性中心基本一致,但Y18的FP中3个位置的氨基酸变为R基较小的氨基酸,并有3个位置的氨基酸被在β-转角处出现频率较高的氨基酸所取代(丝氨酸、天冬氨酸和苏氨酸).这些结构特性可能使Y18 SDH的空间结构更具柔韧性(flexibility),有利于在低温条件下发挥催化功能.     

RT-qPCR检测Wistar大鼠黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因 转录水平方法的建立

目的 建立实时荧光定量(RT-qPCR)检测Wistar大鼠黄嘌呤脱氢酶/氧化酶(XDH/XO)基因转录水平的方法,以在转录水平上对XDH/XO基因进行定量检测。方法 提取Wistar大鼠肝脏组织中总RNA,经逆转录得到cDNA, 以10倍为稀释因子稀释为5个浓度梯度,使用设计的引物序列和内参基因进行RT-qPCR检测,得到XDH/XO基因表达的标准曲线。进而检测Wistar大鼠高尿酸血症动物模型中XDH/XO基因转录水平的变化。结果 RT-qPCR法检测得到的XDH/XO基因标准曲线溶解峰单一,R2接近1,能检测出高尿酸动物模型中XDH/XO基因转录水平的变化。结论 RT-qPCR检测Wistar大鼠XDH/XO基因转录水平的方法具有定量准确,重复性好的特点,可应用于高尿酸血症的发病机理、新药研究等方面。     

固定化乳酸脱氢酶的催化性质研究

研究了固定化乳酸脱氢酶(LDH)的制备和催化性质,讨论了戊二醛体积分数、酶的偶联时间、pH值对酶固定化的影响.对游离酶和固定化酶催化性质的研究结果表明:酶促反应最适pH分别为9.2和10.2,最适温度分别为51℃和50℃,米氏常数分别为16.2 mmol/L和0.7 mmol/L.与游离酶相比,固定化酶的活力稳定性更佳,有更好的贮存稳定性和复用性.     

一种与胆固醇7,8位脱氢相关蛋白的表达研究

家蚕(Bombyx mori)的Nvd-Bm蛋白是一种与胆固醇7,8–脱氢酶相关的蛋白.根据NCBI中报道的家蚕中的胆固醇7,8–脱氢酶基因序列(Gen Bank登录号:AB232986.1),采用密码子优化及基因克隆技术,扩增获得胆固醇7,8–脱氢酶目标基因nvd-Bm,并构建了重组穿梭载体p PIC9K-nvd-Bm,通过电转化,成功构建了含有p PIC9K-nvd-Bm的毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115异源真核表达工程菌株.经SDS-PAGE蛋白电泳分析表明,含有p PIC9K-nvd-Bm的毕赤酵母GS115表达菌株能够成功表达目标蛋白,为胆固醇的7,8–脱氢产物即7–脱氢胆固醇的生物转化奠定了基础.     

盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)KAX-3和AK127细胞形态发生和同工酶的比较研究

比较了盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)野生型细胞KAx-3和突变型细胞AK127在多细胞发育过程中的形态发生.两者有明显的区别;突变细胞的发育只能停留在细胞疏松聚集阶段,而野生型细胞能顺利完成整个发育过程.利用SDS-PAGE电泳比较分析了两者在重要发育阶段的三种同工酶:醋酶(EST)、苹果酸脱氢酶(MDH)和谷氨酸脱氢酶(GDH).结果发现AK127细胞发育阶段含有两种醋酶成分a和p,而KAX-3细胞中只有一种醋酶a;而且AK127细胞中苹果酸脱氢酶(MDH)含量在发育后14 h和16 h均高于KAX-3细胞;谷氨酸脱氢酶(GDH)同工酶在发育后14 h时相对含量高于KAX-3细胞,而在发育后16 h含量却低于KAX-3细胞.这些数据显示了两种类型细胞的同工酶有明显的差异;表明突变细胞基因的表达发生了一定的改变,由此说明了gp150分子在盘基网柄菌细胞发育中有重要作用.     

生物酶对五氯联苯降解的初步研究

多氯联苯（PCBs）是具有代表性的持久性有机污染物（POPs）,其氯代数目越多,降解越难。本文以分离筛选的6株PCBs降解细菌为材料,制备了含有NADH辅酶再生系统关键酶甲酸脱氢酶（FDH）的PCBs降解复合酶,研究了其对PCBs的降解效果。结果表明,Pseudomonas sp. MGB11胞内酶/FDH复合酶对五氯联苯PCB114的降解率在10 h内可达69.4%,对于高毒性、难降解的高氯PCBs的污染修复具有应用价值。     

猕猴不同组织器官中黄嘌呤脱氢酶 /氧化酶基因的mＲNA 表达的半定量 ＲT - PCＲ 检测方法的建立

摘要: 目的 建立半定量 ＲT-PCＲ 检测方法检测猕猴体内肝脏组织、上皮组织、睾丸组织、心肌组织,肾脏组织中黄嘌呤氧化脱氢酶( XDH /XO) 的 mＲNA 的表达。方法 分别提取健康猕猴新鲜肝脏组织、上皮组织、睾丸组织、心肌组织,肾脏组织中总 ＲNA,用 ＲT-PCＲ 二步法进行 XDH /XO 基因片段扩增,内参基因选用管家基因 GAPDH,对获得的目的片段进行序列测定以鉴定其特异性,在凝胶影像分析仪 Quantity one 软件得出其电泳条带的灰度值( IOD) ,计算目的基因与内参基因比值得到猕猴不同组织 XDH/XO 的 mＲNA 的相对表达量。结果 建立了半定量 ＲT-PCＲ 检测方法,猕猴不同组织 XDH /XO 的 mＲNA 表达在肝脏组织中表达水平最高,其次为心肌,肾脏,睾丸,皮肤。结论 本研究所建立的半定量 ＲT-PCＲ 检测方法可应用于检测猕猴各组织器官组中的 XDH /XO 的mＲNA 的表达差异。     

多不饱和脂肪酸与红冬孢酵母低温适应性的关系研究

以一株产油酵母——红冬孢酵母(Rhodosporidium kratochvilovae)YM25235作为出发菌株,分析其低温生长适应性与细胞膜流动性、膜脂脂肪酸含量的变化和多不饱和脂肪酸合成关键基因——Δ12-脂肪酸脱氢酶基因mRNA表达水平的关系.结果显示,YM25235在5～35 ℃温度条件下均能生长,最适生长温度为30 ℃.低温条件下细胞膜流动性明显降低,但是多不饱和脂肪酸质量分数由从30 ℃时的24.35%增加到15 ℃时的40.32%,而且15 ℃时Δ12-脂肪酸脱氢酶基因mRNA水平提高了3.4倍.结果说明低温条件下细胞膜流动性下降,导致多不饱和脂肪酸合成相关基因表达水平提高,使得细胞膜脂中多不饱和脂肪酸含量增加,促进了菌株低温生长适应性.     

budC敲除及ldhA过表达对Klebsiella pneumoniae合成D-乳酸的影响

为了提高K. pneumoniae中D-乳酸的合成效率,本文以BUD和LDH为改造目标,扩增丁二醇脱氢酶基因budC,并在其中插入四环素抗性基因tet,构建了基因敲除载体pTBT,转化K. pneumoniae,利用同源重组技术,敲除K. pneumoniae染色体上的budC基因,得到重组菌K. pneumonia B-;在此基础上,构建了表达载体pKP-ldhA,转化K. pneumoniae B-,过量表达乳酸脱氢酶基因ldhA,得到重组菌K. pneumoniae B-L+。摇瓶发酵结果显示,重组菌K. pneumoniae B-L+的丁二醇合成浓度比原始菌降低了90%以上,D-乳酸合成浓度比K. pneumoniae B-和原始菌分别提高了77.1%和41.4%,发酵罐实验D-乳酸产量68.4g/L,转化率0.78,生产强度1.22g/(L·h)。结果表明,敲除budC及过表达ldhA有利于改善克雷伯肺炎杆菌中D-乳酸的合成。     

His-tag标记的嗜热菌来源L-脯氨酸脱氢酶的纯化与性质

以引入了His-tag做标记的超嗜热菌Thermococcus profundus色素依存性L-脯氨酸脱氢酶基因片段为目的基因,在宿主大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)CompetentCells中表达目的蛋白。细胞培养液经超声菌体破碎、热处理、NiSepharose层析分离,得到纯度较高的His-tag色素依存性L-脯氨酸脱氢酶,比酶活是纯化前的5倍。纯化后的酶液经凝胶电泳分离得到片段为58600,40200,22300的3段短肽。通过对该酶性质的初步探索,得出在温度50℃,体系pH8.0,300mmol/LTris缓冲溶液的条件下,L-脯氨酸脱氢酶酶活最高,为1.5U/mL。