海岸带多源数据三维无缝拼接技术

为解决多源海陆数据中基准不一致、数据模型及格式不统一、同一地物表达上的差异等问题,设计了海陆数据的无缝拼接方案.利用坐标转换和垂直基准差拟合解决空间基准的不一致性,建立统一海部水深离散点和陆部等高线的多源数据无缝数字高程模型(DEM),基于点删除的不规则三角网(TIN)简化算法可实现海岸带模型的多尺度表达.实例分析表明,该方案可实现多源海陆数据的三维无缝拼接和多尺度表达.     

过表达内质网小分子热激蛋白提高拟南芥的衣霉素抗性

内质网小分子热激蛋白是热激蛋白家族成员,具有分子伴侣活性.当植物受到内质网胁迫(ER-stress)时,内质网小分子热激蛋白具有缓解内质网胁迫的功能.我们将CaMV35S启动子驱动的内质网小分子热激蛋白基因AtHSP22.0导入拟南芥,Northern-blotting印迹分析表明,内质网小分子热激蛋白在转基因拟南芥中呈现组成型表达.转基因株系衣霉素抗性强于对照,说明AtHSP22.0的过量表达增强了拟南芥的衣霉素抗性,缓解了ER-stress.     

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)糖基转移酶基因的克隆、序列分析及表达

为获得具有催化活性的糖基转移酶纯酶,本研究以短小芽孢杆菌基因组DNA为模板,利用简并PCR技术扩增到基因(GT-A)全长序列.该序列全长1 287bp、编码423个氨基酸,分子量约为49.2KD.经序列分析,该基因属于糖基转移酶基因.根据GT-A基因开放阅读框序列设计引物,构建了原核表达重组质粒GTA-pet28a,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功诱导出了一个约50kD的融合蛋白.纯化后测定其糖基转移酶活性,与37℃相比,80℃的反应温度其活性能提高3.4倍左右.研究结果表明,该酶是一种具有应用潜力的嗜高温糖基转移酶.     

药材甲热激蛋白基因SpHsp60的克隆及温度胁迫下的表达

本研究采用RT-PCR技术克隆了药材甲热激蛋白60(Heat shock protein 60,Hsp60)基因的cDNA全长序列,命名为SpHsp60(GenBank登录号:KX778623).氨基酸序列分析表明SpHsp60具有Hsp60基因家族高度保守的基序,实时定量PCR技术检测了不同温度胁迫后该基因的表达量,结果表明:-5℃和0℃低温处理2h,药材甲成虫体内的SpHsp60的表达量均显著高于对照组,且42℃高温处理2h后的表达量也显著高于对照组.说明SpHSP60与药材甲应对极端温度胁迫相关.     

F3重组毒素的克隆表达及纯化

以pEKH-F3质粒为模板,PCR扩增F3片段,将F3插入克隆质粒PQE80L,转化大肠杆菌,筛选,获得含有F3的PQE80L重组载体的克隆.提取绿脓杆菌菌株染色体DNA为模板,PCR扩增绿脓杆菌外毒素A催化区,PE40.然后将PQE80-F3和PE40重组,得到表达PQE80L-F3-PE40载体.转化至大肠杆菌DH5a,BL21,表达融合蛋白F3-PE40.结果显示,大肠杆菌表达了融合蛋白F3-PE40,表达的融合蛋白量大概占菌体总体蛋白量的20%.通过质粒提取、PCR扩增构建F3-PE40表达载体转化大肠杆菌,成功地表达了融合蛋白F3-PE40,为大规模表达、纯化F3-PE40的进一步功能奠定了基础.     

尖吻蝮蛇类凝血酶在大肠杆菌中的表达及其优化

将尖吻蝮蛇类凝血酶基因克隆到载体pET32a(+)上,在大肠杆菌Rosetta2(DE3)中表达N端融合了硫氧还原蛋白的类凝血酶.通过SDS-PAGE检测融合蛋白条带,纤维蛋白原凝结实验检测酶学活性.确定表达菌株后,对其诱导条件进行优化,在30℃诱导3 h,诱导剂IPTG浓度为0.5 mmol·L-1条件下类凝血酶表达水平最高.     

牙鲆fibrinogen β基因的克隆及表达分析

 通过mRNA差异显示发现一个鳗弧菌刺激后在牙鲆肝脏中表达量显著增加的片段,结合RACE技术得到了该差异片段1 856 bp的全长cDNA,包含一个1 479 bp的开放阅读框,编码的蛋白质含有fibrinogen β的C末端签名序列。同源性分析表明其氨基酸序列与鱼类以及哺乳类的fibrinogen β都具有高度的相似性,因此可断定此基因为牙鲆的fibrinogen β基因(GenBank登录号为EF581895)。RT-PCR分析表明,在注射鳗弧菌后,该基因在肝脏、肾脏、脾脏、腮、肠、心脏中的表达量呈现逐渐增加的趋势。推测其可能在鳗弧菌侵染中,起到了促进伤口愈合的作用,或通过和其他细胞因子结合在防御细菌的侵染中发挥免疫调节作用。     

重组草酸青霉生淀粉糖化酶的酶学特性鉴定

【目的】了解在毕赤酵母中表达的来源于草酸青霉(Penicillium oxalicum)GXU20的重组生淀粉糖化酶的酶学特性。【方法】用3,5-二硝基水杨酸法测定pH值、温度、金属离子和化学试剂对纯化的重组生淀粉糖化酶的活力的影响,同时测定酶的底物特异性、酶对生淀粉的吸附能力以及酶对不同生淀粉的水解效率等,用高效液相色谱法对该酶水解生木薯淀粉的产物进行分析鉴定,用扫描电子显微镜观察重组酶对不同生淀粉颗粒的水解方式。【结果】重组生淀粉糖化酶rPoGA15A的最适pH值为4.5,最适温度为65℃,在pH值为2.0~10.0时,重组酶具有较好的pH耐受性,温度小于50℃时,酶的稳定性好。除Ag~+、Cu~(2+)和SDS之外,其他大部分金属离子和化学试剂对重组酶的酶活力影响不大。重组生淀粉糖化酶对大米和玉米生淀粉的活性较高,对木薯和马铃薯生淀粉的活性次之,重组生淀粉糖化酶rPoGA15A对不同生淀粉的吸附能力与其对相应不同生淀粉的水解活性大小呈正相关。扫描电子显微镜观察表明重组生淀粉糖化酶对不同生淀粉颗粒的降解作用明显,水解方式各有特点。高效液相色谱分析表明该重组生淀粉糖化酶水解生木薯淀粉的产物仅有葡萄糖。重组生淀粉糖化酶rPoGA15A在40℃下对大米和玉米生淀粉水解72h后水解率分别达到86.5%和71.9%。【结论】重组生淀粉糖化酶具有广泛的pH耐受性,对生淀粉具有高水解活性,在生淀粉的水解和生料同步糖化发酵生产酒精中有一定的应用潜力。     

利用转基因毕赤酵母高表达小分子药用多肽的研究

天然小肽Gsp有明显的降血糖功效,由59个氨基酸残基组成.其编码基因由本实验室设计、合成,并重组构建成表达质粒pPIC9-Gsp. 经电穿孔将该质粒转化为毕赤酵母GS115(His4- mut+),挑选His+ muts型菌株进行重组蛋白胞外表达研究.表达蛋白经Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳分析确定了相对分子质量的正确性,其氨基酸测序显示与天然多肽序列一致,并经紫外扫描分析确定了表达量为344mg/L左右.     

人骨形态发生蛋白6(hBMP6)在毕赤酵母中的分泌表达

以重组质粒pcDNA6A-BMP6为模板PCR扩增hBMP6成熟肽cDNA编码序列,将该序列克隆到酵母分泌表达表达载体pPIC9K中.重组质粒pPIC9K-hBMP6经SacI酶切线性化,电击转化毕赤酵母GS115,PCR法筛选阳性转化子,利用梯度浓度G418筛选到七株高拷贝整合的阳性转化子。用甲醇进行诱导表达,SDSPAGE及Western-blot检测结果表明hBMP6成熟肽以分子量约为34和18 kD两种不同糖基化修饰的单体形式存在,具有良好的免疫原性.