人类肽-甲硫氨酸亚砜还原酶的cDNA克隆、组织表达谱特征及染色体定位

蛋白质结构中某些氨基酸的氧化和还原是生物体内对蛋白功能的一种调控方式．甲硫氨酸（Ｍｅｔ）被氧化则变为甲硫氨酸亚砜（Ｍｅｔ（Ｏ））,它可导致所在蛋白质的生物学活性降低或丧失,但肽－甲硫氨酸亚砚还原酶（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ, ｍｓｒＡ）则可使甲硫氨酸亚砜还原为甲硫氨酸,使其所在蛋白质重新恢复活性．为了研究人体中Ｍｅｔ氧化还原的机制,以牛ｍｓｒＡ ｃＤＮＡ序列为信息探针,筛选人ＥＳＴ数据库,依据若干同源ＥＳＴ的信息从人ｃＤＮＡ分子库中克隆到一个长１２５５ｈｐ的人ＭＳＲＡ ｃＤＮＡ．该ＣＤＮＡ包含一个长７０５ ｂｐ的可读框,它编码了 ２３５个氨基酸残基．同源性比较表明,该基因与牛和大肠杆菌的ｍｓｒＡ基因的氨基酸一致性分别为８８％和６１％．表达谱分析发现,该基因在人体大多数组织中均有一条长约１．６ｋｂ的转录本,并在肾中呈高表达．应用辐射杂种细胞株定位系统（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄ ｍａｐｐｉｎｇ ｐａｎｅｌ, ＲＨ ｍａｐｐｉｎｇ）将该基因精确定位在人染色体８ｐ２２～２３区带的ＤＳＳ５１８和Ｄ８５５５０位标之间,由于此前已有Ｋｅｒａｔｏｌｙｔｉｃｗｉｎｔｅｒｅｒｙｔｈ     

鲁迅文学作品表达机制研究——以《故事新编》为例

作为中国现代史上最伟大的文学家之一,鲁迅之所以能够创作出大量深刻且典型的文学作品,塑造出不朽的文学艺术形象,和其独特的表达机制具有很大关系。特别是在《故事新编》当中,鲁迅引用了一些中国古老的神话故事和历史传说,体现了大量的中国传统文化元素。但在表达方面,整体上却十分隐晦,很难从字面意思上直接了解其创作情感和意图,必须经过深入分析研究之后,才能得到深刻的感悟和理解。为此,以《故事新编》为例,从现实与文本关系、叙事方法等方面着手,对其表达机制进行分析,以此获得鲁迅文学作品中的特色内涵,明确传统文化在新历史时期的重要价值和发展方向。     

酯酶基因Est2的异源表达及酶学性质研究

对来自α/β水解酶超家族的酯酶基因Est2进行了克隆、异源表达及纯化,然后对其酶学性质进行了研究.研究结果显示:酯酶Est2的最适底物为对硝基苯乙酸酯(p-NPC2),最适反应温度为50℃,最适pH为8.0;Est2具有较好的pH稳定性,在pH 5.0～10.0范围内,其相对酶活性保持在50％以上;在40℃条件下具有最...     

密码子优化的植酸酶基因appA-P在毕赤酵母中的高效表达

根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子使用偏爱性,对Escherichia coli来源的高比活植酸酶基因(appA)全面地进行密码子优化,人工合成了植酸酶基因(appA-P),并将该基因克隆到毕赤酵母诱导型分泌表达载体pHBM905A上,获得重组质粒pHBM905A-appA-P,通过PEG1000转化法将线性化的重组质粒转化毕赤酵母GS115菌株,筛选得到一个高效表达植酸酶的重组菌株GS115-appA-P,在25℃摇瓶培养168 h后酶活力达到422 U/mL,该植酸酶最适反应温度为60℃,最适反应pH为4.5,在20~50℃、pH1.0~6.0范围内较稳定.     

用于蛋白亚细胞定位研究的烟草愈伤组织培养条件优化

使用绿色荧光蛋白作为报告基因来研究目的蛋白的亚细胞定位得到广泛应用.使用稳定表达系统研究蛋白的亚细胞定位比较耗时,但可以先选择愈伤组织进行观察以确保构建的载体能够表达.优化了愈伤组织的培养条件,得到了质地疏松柔软的白色愈伤,不受叶绿体的荧光干扰,便于进行荧光观察.     

人胰高血糖素样肽-1串联体的克隆及其表达

为大量获取人胰高血糖素样肽-1,利用基因串联的方法构建了人胰高血糖素样肽-1的一组串联体.将化学合成的人胰高血糖素样肽-1（human glucagon like peptide-1, hGLP-1）cDNA基因插入质粒载体pET-32a(⁺)中,构建成硫氧还蛋白（thioredoxin）及六聚组氨酸（hexahistidine）与rhGLP-1的融合表达载体pET32-GLP-1.在此基础上将该融合基因序列进行同向串联,获得二串和三串的表达载体pET32-GLP-1-2 和pET32-GLP-1-3.将该三种表达载体转化大肠杆菌BLR(DE3)后获得相应的基因工程菌.结果表明：三种基因工程菌经发酵和IPTG诱导后均正确表达目的蛋白,目的蛋白表达量随着基因串数的增加而得到一定提高,重组蛋白经分离纯化后进行生物学活性测试具有明显的降低血糖浓度作用.     

蜘蛛拖牵丝蛋白基因转家蚕表达质粒的构建

利用DNA重组技术对络新妇蛛(Nephila clavipes)拖牵丝蛋白基因MaSp1高度重复序列进行多次重组,人工构建成1.6 kb的蜘蛛拖牵丝蛋白人工基因Sil-E,DNA序列分析证明了人工基因序列的正确性.将家蚕L链基因启动子片段、L链cDNA、L链基因终止子融合在一起,构建成丝腺特异性表达单元.再与Sil-E融合构建成蜘蛛拖牵丝蛋白基因家蚕丝腺特异表达单元.将该表达单元克隆到转座子piggyBac的转基因载体中,获得了蜘蛛拖牵丝蛋白转基因表达载体.采用显微注射法将其与辅助质粒共导入到家蚕蚕卵中.筛选转基因阳性个体,经PCR和Southern杂交鉴定,结果表明目的基因整合到家蚕基因组中,为进一步研究家蚕作为生物反应器表达蜘蛛拖牵丝蛋白基因奠定了基础.     

枯草芽孢杆菌的ade基因在大肠杆菌中的MBP融合表达及活性鉴定

扩增了枯草芽孢杆菌的ade基因, 重组入载体pMal-c2x中, 构建了麦芽糖结合蛋白（MBP）融合蛋白的表达体系. 通过IPTG诱导表达, 用MBP亲和层析法, 纯化该融合蛋白（104 700）, 并通过SDS-PAGE对表达及纯化结果进行检验, 对其酶学性质进行了初步研 究. 分析结果表明: 该融合酶蛋白具有显著的腺嘌呤脱氨酶活性, 证明了ade基因是枯草芽孢杆菌中编码腺嘌呤脱氨酶的基因.     

全长人PPAR-γ的表达、纯化与结构确证

目的建立表达、纯化结构完整的全长人PPAR-γ的方法。方法构建pReceiver-B01-PPAR-γ质粒并转化E．coliBL21（DE3）细胞,诱导表达重组蛋白,优化细胞生长条件;利用亲和色谱和尺寸排阻色谱纯化重组蛋白;胶内酶解重组蛋白,用离子阱质谱仪分析二维AgilentHPLC-Chip纯化的酶解片段;基于MS／MS搜索IPI、Swiss．Prot、NCBInr和MSDB数据库,鉴定重组蛋白。结果在优化的细胞生长条件（TB介质、37℃、0．8mMIPTG、诱导3h）,从每升TB中可获得280mg重组蛋白;两步纯化后,获得176mg、纯度为95％的均质重组PPAR-γ蛋白;经质谱分析和搜索蛋白质数据库,获得均匀地分布在整个PPAR-γ多肽链中的33个阳性肽段,覆盖率为60％,表明重组蛋白为结构完整的全长人PPAR-γ。配体结合活性位点S289、H323、H449和Y473无突变,保证全长人PPAR-γ与配体结合的生物学活性。结论本文所建立的方法能成功用于大量表达结构完整的全长人PPAR-γ,有利于进一步的结构、功能研究和活性配体的筛选。     

抑制消减杂交及反Northern结合高通量筛选食管癌中差异表达基因

为了解食管癌发生的分子遗传学机理,分离食管癌中差异表达的基因,应用抑制消减杂交（SSH）并与PCR合成双链cDNA,反Northern克隆相结合,成功地自微克级总RNA中分离出8个食管癌中差异表达的基因,其中已知基因5个、新基因片段3个,表达下调的6个、表达上调的2个,中－高丰度基因6个、低丰度基因2个,结果显示多个基因的表达改变参与了食管癌的发生发展,其中新发现的lipocortin I,cystatin A,cystatin B,cytoderatin等13个可能与食管癌的去分化、恶性增殖转化有关,SSH与PCR合成双链cDNA,反Northern筛选SSH克隆相结合,是一种高特异性、高通量的自微量RNA中检出差异表达基因的有效方法。