β-1,4-内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达研究

根据芽孢杆菌β-1,4-内切葡聚糖酶基因序列设计引物,以pHBM102为模板,扩增得到β-1,4-内切葡聚糖酶GluD基因片段,克隆至毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pHBM905上,获得重组毕赤酵母表达载体pHBM905D,将此质粒分别转化毕赤酵母GS115,KM71和SMD1168菌株,筛选获得GS115(pHBM905D),KM71(pHBM905D),和SMD1168(pHBM905D),平板诱导培养表明,GS115(pHBM905D)所产生的水解圈最大,酶活力最高.摇瓶诱导培养,表达β-1,4-内切葡聚糖酶,此酶的最适反应温度为65℃,最适反应pH值6.4,在诱导8 d后酶活力达到最高为0.185 8 U/mL.     

多不饱和脂肪酸与红冬孢酵母低温适应性的关系研究

以一株产油酵母——红冬孢酵母(Rhodosporidium kratochvilovae)YM25235作为出发菌株,分析其低温生长适应性与细胞膜流动性、膜脂脂肪酸含量的变化和多不饱和脂肪酸合成关键基因——Δ12-脂肪酸脱氢酶基因mRNA表达水平的关系.结果显示,YM25235在5～35 ℃温度条件下均能生长,最适生长温度为30 ℃.低温条件下细胞膜流动性明显降低,但是多不饱和脂肪酸质量分数由从30 ℃时的24.35%增加到15 ℃时的40.32%,而且15 ℃时Δ12-脂肪酸脱氢酶基因mRNA水平提高了3.4倍.结果说明低温条件下细胞膜流动性下降,导致多不饱和脂肪酸合成相关基因表达水平提高,使得细胞膜脂中多不饱和脂肪酸含量增加,促进了菌株低温生长适应性.     

人整合素β3亚基毕赤酵母表达载体的构建及鉴定

目前研究表明整合素岛亚基是多种病毒的细胞表面受体,然而整合素岛亚基与不同病毒受体结合蛋白VAP相互作用的分子机制还不完全清楚。为此,设计引物,采用RT-PCR方法扩增人岛亚基包膜外区约2．1kb片段,克隆入毕赤酵母表达载体pPIC3．5K中。双酶切鉴定挑取阳性克隆pPIC3．5Kβ3,测序证实目的基因序列正确。将pPIC3．5K-β3,转化毕赤酵母X-程菌GS115,在浓度为3．0mg／mL的G418选择培养基上,筛选出含有多拷贝目的基因的阳性菌株,PCR可扩增出约2．1kb的目的条带。阳性菌株经1％甲醇诱导表达,Western—blot可在酵母菌体中检测到约80kDa的目的蛋白条带。上述结果表明,成功构建了人整合素角亚基毕赤酵母表达载体,筛选获得多拷贝阳性菌株并成功表达,为进一步研究人整合素岛在病毒感染中的作用及其单克隆抗体的制备奠定基础。     

木糖对马克斯克鲁维酵母菊糖酶合成的诱导作用

马克斯克鲁维酵母可利用木糖、菊糖等多种碳源。利用木糖为碳源时菊糖酶产量最高,酶活力可达30．4U／mg菌体（干重）,菊糖次之;利用葡萄糖、乳糖等酶活力均很低。用洗涤菌体进行诱导试验也表明,木糖能诱导该酵母菌菊糖酶的合成,蛋白质合成抑制剂环已亚胺可抑制木糖对该 酶的诱导作用。在以木糖为碳源的生长培养基中添加葡萄糖能明显地阻遏菊糖酶的形成。试验结果表明,该菌株菊糖酶的合成受诱导和分解产物阻遏机制的双重调节,木糖是酵母菊糖酶合成的一种良好的天然诱导剂。     

里氏木霉和酵母菌混合发酵玉米秸杆的研究

对里氏木霉和酵母菌混合发酵秸杆提高其粗蛋白含量的发酵工艺进行了研究。结果表明其发酵最优工艺条件 :以尿素作为氮源 ,里氏木霉接种 2 4 h后接种假丝酵母 ,接种量比例为 1∶ 4 (酵母∶里氏木霉 ) ,于 p H3.0 ,30℃下培养 4 d。粗蛋白含量可达 30 .5 5 % ,粗纤维转化率可达 33.5 %。     

咪唑化合物在金属铜上形成表面膜的可焊性研究

采用上锡率法研究了咪唑化合物在铜表面所成保护膜的可焊性,并探讨了咪唑化合物类型、膜厚、再流焊次数及高温热冲击对该膜可焊性的影响。结果表明,不同类型的咪唑化合物可焊性存在明显差异,可焊性有一最优的厚度。咪唑化合物保护膜的可焊性在经多次再流焊或高温热冲击后有所下降。但双苯基苯并咪唑化合物仍能保持良好的可焊性。     

葡甘露聚糖-虾青素复合物的表征及对AFB1致肉鸡肝损伤的影响

从红法夫酵母提取了葡甘露聚糖、虾青素并制备了葡甘露聚糖-虾青素(GM-ASTA)复合物,对其进行了红外光谱、热失重(TGA)和分子对接模拟分析,探讨了GM-ASTA复合物对黄曲霉毒素B1(AFB1)致肉仔鸡肝损伤的影响.结果表明:葡甘露聚糖和虾青素形成了复合物,前者主链通过范德华力和静电力与后者紧密结合. GM-ASTA复合物能显著地改善AFB1导致的肉鸡肝损伤后果,具有吸附AFB1并解除其毒性的双重功效.     

重组Pichia酵母(Muts)发酵过渡阶段关键酶活分析

重组Pichia酵母表达系统的发酵存在从利用甘油为碳源生长到利用甲醇为碳源表达外源蛋白的发酵表达过渡阶段。Pichia酵母过渡阶段碳源代谢途径关键酶酶活分析表明：甲醇诱导3h AOX2酶活为0,4h时突然增加到0．05U,继续诱导,酶活缓慢增加;在过渡阶段甲醛脱氢酶和6-P-葡萄糖脱氢酶分别增加了6．1倍、2．5倍,而丙酮酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶分别下降为原酶活的29．4％及16．4％,表明甲醇诱导后甲醇完全氧化代谢途径得到强化,而糖酵解途径和三羧酸循环途径代谢作用减弱。     

人载脂蛋白基因apoAI在毕赤氏酵母中的表达

将化学法合成的apoAI基因插入分泌型载体pPIC9K．将重组的pPIC9K—apoAI用BglⅡ酶切后，转化Pichia pastoris GS115菌株，筛选获得G418高抗性转化子．转化子经摇瓶发酵和甲醇诱导，上清液用SDS-PAGE检测，有明显的rApoAI表达．经Phenyl—sepharose 6(Fast Flow)疏水层析柱和Sephadex G-50(coarse)分子筛层析，得到rApoAI蛋白纯品．经Western blotting，N末端氮基酸顺序测定证明，毕赤氏酵母表达的rApoAI与人血浆提取的ApoAI基本一致．