Lat52介导的特异性表达载体的构建及其鉴定

利用含花粉特异性启动子Lat52的质粒pLat52－7、含细胞毒素A链基因的质粒pGA968以及表达质粒载体pGA987，构建了含有Lat52特异性启动子和细胞毒素A链基因的表达载体，经酶切和PCR进行鉴定，证明所构建的重组载体即为实验所需的载体质粒，从而为下一步的转化模式植物拟南芥菜打下了基础。     

PCR法快速鉴定阳性克隆实验的改进

分析了常规PCR扩增鉴定阳性克隆实验中存在的问题,进行了改进探索:反转录PCR(RT-PCR)获得目的基因片段,TA克隆连接质粒载体、转化大肠杆菌感受态细胞;利用目的基因的特异性引物,用菌液PCR法直接筛选重组克隆,在筛选的阳性菌液中扩增到与目的基因片段大小一致的阳性条带,与质粒PCR及酶切的阳性对照一致,验证了菌液PCR具有可靠性。实验证明,自身引物菌液PCR法用于定性筛选重组阳性克隆,是一种简便、快速、有效的方法。     

环境工程中微生物分析方法研究进展

本文阐述了环境工程中常用的微生物分析方法原理及其应用,重点介绍了目前应用较多的聚合酶链式反应(PCR)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、PCR-DGGE分子生物学分析方法原理,探讨了PCR-DGGE技术在国内外环境工程中的应用,分析了微生物分析方法的现状以及PCR-DGGE技术用于生物处理系统中微生物群落多样性和动态性研究的现状、前景和改进的策略。     

免疫PCR技术的策略

免疫PCR是一种新兴的免疫标记技术，具有高敏感性和特异性的特点．本文对免疫PCR的方法、DNA标记探针的构建及扩增产物的检测进行了综述．     

布吉河枯水期总细菌和反硝化功能基因定量研究

为了研究污染河流中微生物群落结构的存在状况及与水环境因子的关系,以深圳市深圳河的一级支流布吉河为研究对象,采用DGGE和Q-PCR技术分析了布吉河不同断面水样和沉积物中总细菌数量和群落结构以及反硝化基因(nosZ和narG基因)数量变化。结果表明,水样中总细菌数量的变化范围为5.77×108~7.13×1011copies/L,nosZ和narG基因数量的变化范围分别为2.99×106~9.39×108copies/L和1.45×107~9.11×109copies/L。沉积物中总细菌数量的变化范围为1.14×109~1.61×1011copies/g,nosZ和narG基因数量的变化范围分别为1.52×106~3.80×107copies/g和2.38×107~2.93×108copies/g。由于生境的差异,沉积物中nosZ和narG基因丰度高于水样。冗余度分析表明,影响微生物数量和群落结构的水环境因子不同,Fe是影响布吉河水样中细菌数量的主要水环境因子,而COD、亚硝氮和硝氮是影响布吉河微生物群落结构的主要水环境因子。水样和沉积物中微生物生态功能都很稳定,但水样中总细菌多样性比沉积物中高。     

桑树萎缩病类菌原体的PCR检测

通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ），用多对引物探讨了桑树萎缩病类菌原体的分子检测．结果显示，所用引物中只有Ｒ１６Ｆ２／Ｒ２和Ｒ１６（Ⅰ）Ｆ１／Ｒ１适用于桑树萎缩病类菌原体的检测，呈现不同症状的黄化型、萎缩型和其它两种类型的病株都扩增出类菌原体１６ＳｒＤＮＡ的片段．根据组特异性引物对四种症状类型中类菌原体１６ＳｒＤＮＡ的扩增，对我国桑树萎缩病类菌原体的分组状况进行了讨论．     

重组β-葡萄糖醛酸苷酶转化甘草酸的定向性改造

为提高重组β-葡萄糖醛酸苷酶的底物特异性,通过易错PCR方法对其进行突变并构建突变体文库,利用薄层层析和高效液相色谱对突变文库进行筛选,获得了突变株PGUS（M51）E,其底物特异性提高了41％。突变酶的酶学特性研究发现,该突变酶的最适pH值和温度较PGUS-E无显著变化,酶活力下降了16．86％,T。值提高了5℃;序列分析结果表明：PGUS（M51）-E共发生5处突变,其中3处发生在糖基结合域。因此,利用定向进化策略能有效提高伊葡萄糖醛酸苷酶的底物识别特异性。     

绵羊β-乳球蛋白基因调控序列的分离、克隆及序列分析

根据绵羊β－乳球蛋白基因调控区ＤＮＡ序列设计了两个引物，以绵羊基因组ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ技术扩增，得约９００ｈＰ的ＤＮＡ片段插入到ｐＵＣ１８质粒的ＸｂａＩ／ＫｐｎＩ位点之间．ＰＣＲ产物的克隆经双酶切、ＰＣＲ检测和序列分析证明是绵羊β－乳球蛋白基因的调控序列．序列分析结果表明该克隆片段与绵羊β－乳球蛋白基因相应ＤＮＡ序列相比有很高的一致性．研究结果为指导异源基因的表达和进一步利用乳腺特异表达的转基因动物生产医用蛋白提供了有效的调控序列．     

Amplification of the miR-181c/d cluster is inversely correlated with PDCD4 expression in gastric cancer

miR-181c/d is dysregulated in gastric cancer （GC）. We investigated the amplification and expression of miR-181c/d and its predicted target genes in GC. Amplification of miR-181c/d was quantified by genomic real-time PCR in GC and adjacent normal tissues, as well as the levels of mature miR-181c/d was performed by real-time PCR in the same tissues. The potential target genes of miR-181c/d were predicted using bioinformatics software. Expression of one potential target gene, PDCD4, was measured by semiquantitative RT-PCR, real-time PCR, and immunohistochemistry. Next, the relationship between miR181c/d expression and PDCD4 expression was analyzed. Results indicated that the amplification and expression of miR-181 c/d were significantly higher in GC than in adjacent normal tissues （primary miR-181 c/d, P 〈 0.001; miR-181 c,P = 0.0344; miR-18 ld, P = 0.0153）, and there was a strong correlation between mature miR-181c/d and primary miR-181c/d. Thirty-two target genes were predicted, including PDCD4 which is a known tumor suppressor gene. Expression of PDCD4 was significantly down-regulated in GC as compared to adjacent normal tissues and was inversely correlated with miR-181c/d expression in GC （miR-18lc and PDCD4： R = -0.496, P = 0.008; miR-181d and PDCD4： R = -0.454, P = 0.003）. Therefore, miR-181c/d may play a pivotal role in the pathogenesis of GC by down- regulating PDCD4 expression.     

番鸭HSP70的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及其初步应用

旨在建立一种高灵敏度的番鸭热休克蛋白70(Heat shock 70, HSP 70)基因的荧光定量PCR检测技术，并以此技术检测番鸭在热应激前后HSP70基因转录表达量的变化情况。由NCBI上HSP 70基因保守序列来设计特异性引物，将试验番鸭的mRNA反转为cDNA,检验其重复性、特异性和灵敏度，利用建立的方法对热应激条件下番鸭体内各组织基因的转录变化进行检测。结果表明：本研究构建的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法所用的引物特异性较好，与1.35×10²～1.35×10⁷ copies/μL的PCR产物之间存在着良好线性关系，方程为y=-1.96 x+18.2,相关系数为-0.983,扩增效率为226.55%;熔解温度T_m值为(84.0±1.0)℃,曲线呈特异性单一峰；该方法的灵敏度为1.35×10² copies/μL。与正常条件相比，热应激条件下番鸭血液、心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肌肉的HSP 70基因表达水平显著升高(P<0.05)。该研究成功构建了番鸭HSP 70基...