大肠杆菌碱性磷酸酶突变体的构建及其结构与功能研究

以大肠杆菌碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)高活性突变株(L138PG233S)为亲本,采用重叠延伸PCR的方法进行定点突变,成功获得了氨基酸替换突变体3个,并对它们的酶活性、特性、内源荧光发射峰等与亲本酶进行了比较分析.结果发现:与亲本酶相比,突变体酶的酶活性降低了18%～85%,Vmax值降低,Km增加,内源荧光发射峰λmax增大等.与亲本酶相同,Zn2 ,Mn2 ,Mg2 仍是它们的激活剂,Na3PO4是它们的抑制剂;这些实验结果说明突变体酶活性的降低直接与其构象变化有关,被替换的氨基酸在维持碱性磷酸酶的结构和功能方面具有特定的作用.     

高效热不对称交互式PCR技术克隆地黄基因

利用高效热不对称交互式PCR(hiTAIL-PCR)技术从地黄基因组中扩增出3个DNA片段,经过电泳检测、回收、纯化和测序获得2个片段的碱基序列.其中一个由578个bp组成,包含一个453bp的开放阅读框(ORF),编码151个氨基酸,与一些已知纤维素合酶基因在DNA水平和氨基酸水平的同源性分别高达81%~91%和83%~99%,而且推测蛋白质具有纤维素合酶的结构域;另一个由385个bp组成,没有ORF,不编码蛋白质,但是,预测其包含启动子元件.这些结果表明使用hiTAIL-PCR技术可以克隆地黄基因,克隆的基因将为地黄基因分子作用机制和分子育种研究奠定基础.     

荧光定量RT-PCR检测脑心肌炎病毒方法的建立及初步应用

根据GenBank中公布的脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus EMCV) 3D基因保守区段设计并合成1对引物, 以提取的EMCV核酸为模板, 分别进行荧光定量RT PCR扩增, 优化反应体系及条件, 建立脑心肌炎病毒荧光定量RT PCR检测方法, 并初步运用于静注人免疫球蛋白(IVIG)纳米膜过滤工艺去除EMCV效果的验证. 结果显示该方法实验内和实验间的精密度均小于5%, 最低检测限为102 copies/ μL; 纳米膜过滤工艺可使样品中的EMCV滴度下降4Logs.     

葡萄籽原花青素对营养肥胖模型大鼠肠道菌群的影响

以高脂膳食喂养大鼠,复制营养肥胖模型,然后灌胃原花青素,采用变性梯度凝胶电泳,实时荧光定量等不依赖微生物培养的手段和多元统计分析方法,研究葡萄籽原花青素对营养肥胖模型大鼠肠道菌群生态的影响。结果表明,低剂量(100mg/(kg·体重·d))原花青素可以显著抑制大鼠肥胖,处理后大鼠肠道菌群结构与模型组分离;葡萄籽原花青素显著降低了肥胖大鼠肠道菌群中厚壁菌门的含量,提高了拟杆菌门的含量,显著降低了厚壁菌门与拟杆菌门比值;实时荧光定量检测显示,原花青素可以促进拟杆菌增殖,抑制柔嫩梭菌增殖,初步揭示出葡萄籽原花青素可能具有调节肠道菌群的功能;原花青素作用的关键微生物种属为Blautia, Bacteroides, Lactobacillus, Anaerostipes, Clostridium, Anaerofilum。     

SPF级实验小鼠4种致病菌多重PCR方法的建立及优化

目的 建立一种可同时检测4种SPF级屏障环境常见致病菌的多重PCR方法。方法 本研究针对鼠伤寒沙门氏菌invA基因、肺炎克雷伯杆菌khe基因、嗜肺巴斯德菌16SrRNA基因、铜绿假单胞菌ecfX基因序列分别设计合成特异性引物,构建可同时鉴别4种菌的多重PCR反应体系,优化后测定其特异性、灵敏性并人工模拟感染样本。结果 建立的4重PCR方法能对同一样品中的4种致病菌模板进行特异性扩增,无交叉反应;对4种目的菌的检测灵敏度为10-3ng/μL;也可从混合感染的病料中特异性地检测出4种致病菌。结论 本试验建立的多重PCR方法具有快速、简便、灵敏的特点,为4种致病菌的快速诊断和监控提供了有效的技术支持。     

新型马尔尼菲青霉菌Rho GTPase激活因子的RNAi研究

为探讨马尔尼菲青霉菌RhoGTPaSe激活因子基因的功能,构建了以xylP为启动子,靶基因正反双向序列被550bp gus序列隔开的干扰该基因表达的载体pCB309A-XRGT．利用根癌农杆菌的介导转化马尔尼菲青霉菌,并以博莱霉素抗性筛选;实时定量PCR（Real-time quantitative PCR）检测发现该载体的干扰效率达83％,Rho GTPase激活因子基因的表达受干扰后,马尔尼菲青霉菌的菌丝生长受到抑制,菌落也较野生型及对照菌株显著变小．     

兔后肢失用后兰诺定受体与受磷蛋白 mRNA转录水平的变化

探讨参与肌浆网中钙离子释放的兰诺定受体(ryanodine receptor,RyR)、受磷蛋白(phospholamban,PLN)的mRNA转录水平与失用性肌萎缩的关系。将依次编号的30只新西兰大白兔按随机数字法分为6组。分别设置为对照组和实验组5组。实验组采用长腿石膏固定法建立兔失用性肌肉萎缩模型,于2周、4周、6周、8周、10周分别处死兔子5只。对照组于第10周处死兔子5只。取固定侧肌肉组织,用定时定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)法测定兔固定侧肌肉的RyR与PLN的基因转录水平。RyR的mRNA转录水平在第2周升高,自第2周开始转录水平逐渐下降。PLN的mRNA转录水平表现为逐渐下降的趋势。在失用性萎缩发展过程中,PLN和RyR mRNA随着肌肉萎缩程度的不断加深呈现趋势性变化,可望用于失用性肌萎缩程度的推断。     

牛α—s1酪蛋白基因3‘端DNA的PCR扩增,克隆及鉴定

本研究以牛血总ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ技术扩增牛α－ｓ１酪蛋白基因的５＇端３．６ｋｂＤＮＡ片段和３＇端１．５ｋｂＤＮＡ片段的调控区序列，得到了相应的特异性扩增片段．用Ｋｌｅｎｏｗ处理后，将两个扩增片段分别与经Ｓｍａｌ酶切的ｐＵＣ１８质粒载体用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化大肠杆菌ＪＭ１０９．在含有Ｘ－ｇａｌ，ＩＰＴＧ和Ａｍｐ的选择培养基上培养．从白色菌落中提取质粒ＤＮＡ，进行限制酶切鉴定．结果得到一个插入有１．３ｋｂＤＮＡ片段的阳性克隆．对其进行部分序列分析表明，该片段为５＇端缺失约１７０ｂｐ的牛α－ｓ１酪蛋白基因３＇端及下游区序列．     

人胰岛素样生长因子—Ⅰ的基因克隆,融合表达及产物纯化

利用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）方法,以ＩＧＦ－ＩｃＤＮＡ为模板,扩增ＩＧＦ－Ｉ的基因。在序列测定确证后,将其定向克隆到载体ｐＥｘＳｅｃＩ上,构建了ＩＧＦ－Ｉ融合表达载体ｐＥｘＩＧＦ,经ＩＰＴＧ诱导表达后,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明：含有重组表达质粒的菌株可表达出约３２．５８％的２６ＫＤ融合蛋白,且主要以可溶性形式存在。经ＩｇＧ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析一步纯化后,可获得纯度约９０％的融合蛋白,经Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ分析,免疫学活性呈阳性反应。     

微流控PCR生物芯片及其检测技术的研究

微流控芯片的目标是把整个化验室的功能,包括采样、稀释、加试剂、反应、分离和检测等集成在可多次使用的微芯片上。检测系统是芯片系统研究的关键之一,影响整个微流控芯片分析系统的检出限、检测速度、适用范围以及体积等指标,是微流控芯片分析系统的一个关键部分。本文针对微流控芯片的发展及其检测技术进行了研究,并分析了目前发展的现状和趋势。