用酵母双杂交系统筛选与NifA相互作用的蛋白质

利用酵母双杂合系统从巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Sp中筛选与NifA有直接相互作用的蛋白质因子. 首先将nifA基因克隆到pGBD-C2载体上, 构建成诱饵质粒pGBD-nifA, 接着将巴西固氮螺菌的染色体DNA构建在pGAD-C1, pGAD-C2和pGAD-C3质粒载体上, 形成3个质粒文库YSPC1, YSPC2和YSPC3. 然后以pGBD-nifA为诱饵, 对YSPC1, YSPC2和YSPC3这3个文库进行了筛选, 得到11个阳性克隆. DNA序列分析表明, 这11个阳性克隆分为4类, 包含4个1~1.3 kb不同的基因片段. 对这4个基因片段进行同源性比较发现, 其中2个编码的蛋白质含有与信号传递有关的PAS结构域, 另外1个基因片段含有与吸收铁有关的fhuE基因, 另一个是未知蛋白. 将这4个基因片段从原来的pGAD载体转移到pGBD载体, 即互换换载体后, 它们仍然与NifA有相互作用; 对这4个基因片段进行移码突变则不再与NifA有相互作用, 说明了它们与NifA相互作用的特异性.     

水稻WRKY89中的亮氨酸拉链结构增强蛋白与W盒元件的相互作用

WRKY蛋白是一类参与植物生物和非生物胁迫反应、代谢、发育等过程的转录调节因子. 水稻WRKY89与其他的WRKY成员同源性较低, 推测由263个氨基酸组成, 其N端带1个可能的亮氨酸拉链结构. 采用pET-29b载体原核表达了OsWRKY89和其3个N端缺失的衍生物, 并采用Ni柱的方法对表达的蛋白进行了纯化. 凝胶阻滞结果表明, OsWRKY89能与含顺式元件W盒的DNA序列特异结 合, 而缺失N端亮氨酸拉链的OsWRKY89与该元件的结合能力显著下降. 酵母双杂交结果表明, 亮氨酸拉链样结构参与OsWRKY89蛋白的同源相互作用. 进一步缺失OsWRKY89至部分WRKY结构域导致表达的蛋白完全丧失与上述元件的结合活性, 表明WRKY结构域是DNA结合中不可缺少的. 这些结果说明亮氨酸拉链结构在蛋白质与蛋白质互作和DNA与蛋白质中起重要作用.     

利用鳞翅目来源的转座子piggyBac建立高效稳定的转基因家蚕技术

piggyBac转座子元件被成功应用于家蚕转基因. EGFP荧光蛋白基因作为筛选标志, 受含有Pax-6结合位点的启动子控制, 并能在家蚕的眼部组织中特异性表达. 荧光筛选质粒和piggyBac转座子表达质粒被以混合物的形式显微注射到家蚕受精卵, 获得出生的G₀代蛾子700个, 互相交配后, 利用EGFP荧光筛选获得111个独立的转基因系. 大部分转基因系在基因组上携有2个或多个插入拷贝, 并且在整个项目过程中转基因的表型稳定遗传6代以上. 对插入位点的序列鉴定发现, 其插入位点两侧具有特异性TTAA序列, 证实转基因的插入受到piggyBac转座子的调控. 高效稳定的家蚕转基因技术的建立为家蚕后基因组的研究和蚕业工业的发展提供了基础.     

裂殖酵母细胞周期调控机制的系统建模与分析

以酵母细胞周期行为作为研究对象, 综合分析了Puc1, Cig1, Cig2和Cdc13共4种周期蛋白在细胞周期G1/S, G2/M和M后期转换的调控作用, 绘制了周期调控机制的蛋白相互作用网络图, 并建立了对其动态行为进行描述的数学模型. 通过对不同突变体种型模拟结果的比较, 进一步说明了各种周期蛋白在细胞周期进程中对S期启动、G2/M周期时相转换所起的作用.     

藻红蛋白微晶的激子光谱

光合作用天线系统起着吸收太阳能并把能量传递到反应中心的作用.光合作用天线系统中的能量传递已被证实非常高效和快速.实验证实,在藻类光合作用天线中,从藻红蛋白经藻蓝蛋白和变藻蓝蛋白至反应中心,总能量传递效率超过90%;而时间分辨荧光谱实验证实,在完整细胞中,能量从藻红蛋白传递至反应中心全过程在小于50ps时间内完成.藻胆体是红藻和蓝藻的重要光合作用天线.藻胆体由核(core)和杆(rod)组成,核主要含变藻蓝蛋白,核的一面附着在类囊体膜上并与反应中心相联,另一半与多根杆相联组成半球     

表皮生长因子受体体外测活的非同位素方法

建立了一种表皮生长因子受体体外测活的非同位素方法。通过克隆表皮生长因子受体主要磷酸化位点Ｔｙｒｌ１７３周围２０肽的基因片段与谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＧＳＴ）的融合蛋白作为底物,用抗磷酸化酪氨酸的单克隆抗体ＰＹ９９来检测其磷酸化的程度。此方法在专一性及灵敏度上都比已有方法有显著提高。融合蛋白的Ｋｍ值（１０μｍｏｌ／Ｌ）比合成多肽底物的Ｋｍ值（１１０μｍｏｌ／Ｌ）要低一个数量级。此方法还可用于测定ｃ－ｅｒ     

番茄碱对棉铃虫毒性分析

本文主要研究了番茄碱对棉铃虫的毒性作用．实验结果表明：（1）用不同浓度的番茄碱（tomatine）浸泡的棉花叶饲喂棉铃虫时，随浓度的增加及时间的延长，对棉铃虫的杀伤力增强．结果显示：饲喂第三天时，1mmol／L的浓度引起48％死亡，2mmol／L时60％死亡，4mmol／L时76％死亡，其IC50为1．78mmol／L．（2）用紫外光谱分析测得虫体内钙调蛋白的含量，结果显示：tomatine对其体内钙调蛋白的影响较大，随tomatine浓度的增加，钙调蛋白的含量逐渐降低．（3）紫外光谱图谱显示：番茄碱与钙调蛋白形成了一种新的物质（其特征吸收峰在190nm-220nm）．说明tomatine对棉铃虫的杀伤作用与钙调蛋白有关，此项研究为进一步探讨tomatine的作用分子机制提供了科学参数．     

原发性子宫内膜癌与p16基因突变及蛋白表达关系的研究

目的研究p16蛋白表达与原发性子宫内膜癌发生发展的关系和p16基因缺失突变及点突变在原发性子宫内膜癌发生发展中的地位.方法利用免疫组织化学方法、聚合酶链反应和聚合酶链反应-单链构象多态性分析技术,分别检测正常子宫内膜组织、子宫内膜癌前病变组织及原发性子宫内膜癌组织,观察p16蛋白和p16基因缺失突变及点突变.结果1)p16蛋白阳性表达率在正常子宫内膜组织和子宫内膜癌前病变组织中表达率分别为92.78%和90.00%,两者相比无差异性;在原发性子宫内膜癌组织中为66.67%,明显低于正常子宫组织及癌前病变组织;2)在42例原发性性子宫内膜癌组织中有14例发生p16基因缺失突变,4例发生了p16基因点突变,突变率为分别为33.33%和9.6%,正常子宫颈组织和子宫内膜癌前病变组织未发现p16基因缺失突变和点突变.结论1)在原发性子宫内膜癌发生发展过程中,p16蛋白的表达在高分化癌明显低于低分化癌,表明p16蛋白缺乏与子宫颈细胞增殖失控及分化不良紧密相关.2)原发性子宫内膜癌存在p16基因点突变,以低分化癌多见,但不是较频繁的事件;原发性子宫内膜癌存在p16基因缺失突变,以低分化癌多见,是较频繁的事件.3)p16蛋白表达与p16基因突变的相关性未被发现.     

胶体金标记牛血清白蛋白及其在电场中的迁移行为

采用柠檬酸钠还原法制备了不同粒径的胶体金,对牛血清白蛋白(BSA)进行标记,考察了胶体金标记BSA的影响因素.以琼脂糖凝胶为载体介质,研究了三种粒径的胶体金及其BSA复合物在电场中的迁移行为.结果表明,pH值、离子浓度、蛋白量都会影响胶体金对BSA的标记.标记的最适条件是:无盐或极低盐浓度,pH值5.8,蛋白加入量不小于最小稳定蛋白量.胶体金及其BSA复合物在特定电场中的迁移行为类似于火箭免疫电泳,其迁移速度随着金纳米粒子粒径的增大而减小;金纳米粒子与BSA结合后迁移速度减慢,BSA的加入量对复合物的迁移速度无影响.