携带人凝血因子Ⅸ突变衍生物基因重组腺相关病毒的大量制备与体内外表达研究

构建了一系列携带有人凝血因子Ⅸ突变衍生物基因（ｈⅨＲ３３８Ａ）及不同调控元件的腺相关病毒 表达载体,并经体外转导不同的细胞系,筛选、优化,挑取高表达质粒及其转导稳定细胞克隆,然后, 以一个携带有腺相关病毒包装蛋白的ｒＡＡＶ/ＨＳＶ杂合病毒包装系统介导进行重组腺相关病毒的大量制 备,建立了可进行产业化制备的技术路线及高滴度、大量制备重组腺相关病毒的技术方法,所获得的重 组病毒滴度达 １．２５ × １０１２病毒颗粒／ｍＬ,然后,利用这一重组病毒,对ｒｈＦⅨＲ３３８Ａ进行离体及在体表达, 获得了 ｒｈＦⅨＲ３３８Ａ在肌细胞系 Ｃ２Ｃ１２及血友病 Ｂ小鼠体内的高效表达,表达峰值分别达（２５５１．３２± ９２．１４）ｎｇ·（１０６细胞）－１·（２４ｈ）－１及４６３．２８ｎｇ·ｍＬ－１,与野生型Ⅸ因子的表达水平（２５６５．７６±６４．３６）ｎｇ· （１０６细胞）－１·（２４ ｈ）－１及４５３．９２ ｎｇ· ｍＬ－１无显著性差异．然而,其凝血活性却成倍增加,约为后者的 ２．４６倍.．将人凝血因子Ⅸ突变衍生物基因引入血友病 Ｂ基因治疗研究之中,同时,探讨了一个新的包装 系统──ｒＡＡＶ／ＨＳＶ杂合病毒包装系统──在重组ＡＡＶ载体大量制备中的应用     

激活的凝血因子——肿瘤相关巨噬细胞对胃癌腹膜转移生物学行为影响的研究

近年来研究表明恶性肿瘤的高凝状态与肿瘤的侵袭、增殖和转移有着密切的关系，高凝不仪可以使肿瘤细胞包裹在纤维蛋白和血小板的聚合物中，逃避免疫监视，而且还可直接导致凝血酶的产生，通过活化多种信号传导机制促进肿瘤新生血管生成和肿瘤转移。     

钙离子及酸度对蛇毒抗凝血因子溶液构象的影响

用荧光光谱方法研究了Ｃａ２＋离子对抗凝血因子（ＡＣＦ）溶液构象的影响,证实了Ｃａ２＋离子不仅能与ＡＣＦ可逆结合,还能维持ＡＣＦ的结构．脱去Ｃａ２＋离子后的ＡＣＦ中约有４６％的Ｔｒｐ残基相对暴露在外．在一定的酸度范围内,酸度对ＡＣＦ的结构影响不大．     

钇铁石榴石磁光薄膜光吸收谱的理论计算

采用DV-Xa方法计算了（Fe∧3 O∧2-6）∧-9和（Fe∧3 O∧2-4）∧5- 的原子簇的电子结构，计算得出：在3.5eV以下，八面体只内只存在晶场跃迁，O2p→Fe3d之间的电荷转移跃迁只有四面体内存在，在12×10∧5～25×10∧5m∧-1波数范围计算了YIG薄膜的光吸收谱，理论谱与实验谱符合得较好。     

肝移植期间血浆肝素活性和全血激活凝血时间态变化关系的研究

目的动态测定肝移植患者围术期不同阶段血浆肝素活性和全血激活凝血时间(ACT),探讨肝素活性和ACT变化的规律,为改善肝移植患者的凝血功能提供理论依据.方法采用Ⅹa因子抑制法检测肝移植患者在切皮前、下腔静脉开放前、下腔静脉开放后5 min、开放后1,2,3 h共6个时点的血浆肝素活性,同时测定在各个时点的ACT.结果在肝移植的各个阶段,即切皮前、下腔静脉开放前、下腔静脉开放后5 min、开放后1,2,3 h的肝素活性均数分别为0.41,0.42,0.96,0.70,0.44,0.42 IU/mL.开放后5 min时的血浆肝素活性最高,与其他各时点比较具有统计学意义(P<0.05);开放后1 h较开放后5 min有所下降,但仍高于其他各个时点(P<0.05);切皮前、开放前、开放后2 h和开放后3 h的血浆肝素活性无统计学意义(P>0.05).在切皮前、下腔静脉开放前、下腔静脉开放后5 min、开放后1,2,3 h的ACT均数分别为158.8,147.1,250.6,215.0,169.9,164.7 s.开放后5 min时的ACT最长,与其他各时点比较具有统计学意义(P<0.05);开放后1 h较开放后5 min有所缩短,但仍长于其他各个时点(P<0.05),切皮前、开放前、开放后2,3 h的ACT无统计学意义(P>0.05).血浆肝素活性和ACT之间变化趋势一致,且二者之间存在线性关系,相关系数为0.725(P<0.05).结论在肝移植期间,下腔静脉开放后血浆肝素活性和ACT迅速上升,开放2 h后逐渐下降至接近入室时水平.肝移植过程中ACT和血浆肝素活性之间存在相关关系.     

小鼠凝血因子Ⅸ基因组DNA的结构分析和ES细胞基因打靶研究

为了利用ＥＳ细胞基因打靶技术建立人血友病Ｂ的转基因小鼠模型，用小鼠ＦＩＸ基因ｃＤＮＡ为探针，筛选１２９Ｓｖ小鼠的基因组ＤＮＡ噬菌体文库，从２＊１０＾５个噬斑中得到５个独立的阳性噬菌体克隆。     

小鼠造血干细胞的分离、培养及重组慢病毒载体介导的离体hFⅨ基因表达

造血干细胞是基因治疗理想的靶细胞之一,尤其适用于遗传性血液病.而重组慢病毒载体能高效感染造血干细胞,成为造血干细胞途径基因治疗的理想载体.从小鼠骨髓细胞中分离出单个核细胞(MNCs)进行体外悬浮培养,并用免疫磁珠法分离得到高纯度的小鼠Lin-CD117+造血干细胞(HSCs).体外悬浮培养期间,添加细胞因子的造血干细胞的细胞数和集落数逐渐增加,而未添加细胞因子的对照组的细胞数量无明显增加,细胞集落递减.用磷酸钙介导的共转染法制备了携带FⅨ基因的FUXW重组慢病毒,用慢病毒载体分别感染从ICR小鼠和C57小鼠中分离得到的MNCs,7d后测得细胞上清中hFⅨ的表达量分别为41.7±4.2和34.5±6.6ng/mL,而慢病毒感染C57小鼠造血干细胞,添加细胞因子组上清中hFⅨ的表达量为46.6±5.7ng/mL,不添加细胞因子组为33.3±4.8ng/mL.实验结果表明,重组FUXW慢病毒载体可有效感染小鼠单个核细胞和Lin-CD117+造血干细胞,添加细胞因子可提高转移基因的表达量.     

转有人凝血因子IX cDNA的家兔成纤维细胞在家兔体内的高效表达和检测

凝血因子Ⅸ(简称Ⅸ因子)是人体内凝血系统的重要成分之一.它的缺乏或功能缺陷可导致血友病B的发生。近年来,随着高效安全的基因转移技术迅速发展,血友病B的基因治疗已取得突破性进展,逐渐从实验室走向临床试验阶段,并已获得了令人可喜的成果.在血友病B的基因治疗研究中,我们构建了人凝血因子Ⅸ cDNA的双拷贝病毒载体(double-copy     

采用重组小鼠凝血因子Ⅸ制备单克隆抗体的研究

将小鼠凝血因子Ⅸ (mFⅨ )cDNA蛋白编码区序列克隆至原核表达载体 pQE30 ,在大肠杆菌M 15中获得高效表达 (约占细菌蛋白总量的 5 1 2 % ) ,并经过SDS PAGE纯化获得均一的重组mFⅨ蛋白 .以此蛋白为抗原 ,免疫Lou/MN系大鼠 ,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞 (Sp 2 / 0 )融合后 ,经 3次克隆化选择获 2株杂交瘤细胞(H4B5和C2B10 ) .以 1× 10 6杂交瘤细胞注射免疫缺陷型裸鼠 ,10d后获得腹水 .对此单抗的功能和特异性初步研究表明 ,所制备的抗小鼠FⅨ单抗可用于Western免疫印迹等研究 .