血友病B基因治疗进展

血友病B是一种严重的凝血功能缺陷遗传病，由于现行的治疗方法对血友病B的治疗效果均不令人满意。因此，有必要开展血友病的基因治疗研究。本文介绍了血友病B的发病机理以及以反转录病毒载体为工具进行血友病B基因治疗的研究进展。     

HSV/AAV嵌合病毒法制备rAAV/hFⅨ及其安全性检测

构建了由CMV启动子调控的人凝血因子Ⅸ小基因的重组腺相关病毒载体, 并通过HSV/AAV杂合辅助病毒的方法大量制备成重组腺相关病毒颗粒(rAAV/hFⅨ). 经Southern dot blot及QC-PCR法测定, 滴度达到3.6 × 10¹² vg(病毒基因组)/mL. 将rAAV/hFⅨ病毒以7.5 × 10¹¹ vg/只直接注射到血友病B小鼠股四头肌中, 检测到人Ⅸ因子最高表达量达到387 ng/mL血浆, 持续表达时间12周. 血浆中产生的抗体情况与表达曲线相吻合. 实验结果表明, 采用HSV/AAV杂合辅助病毒法能够有效解决AAV载体的大量制备问题, QC-PCR法检测重组腺相关病毒的滴度比传统的点杂交法更加快速准确. RT-PCR检测表明重组AAV中没有野生型HSV的污染, PCR检测表明重组AAV注射后, 重组AAV病毒仅存在于注射点附近的肌肉中, 未见扩散.     

人凝血因子Ⅶ在CHO/DG44细胞中的表达

PCR法扩增FⅦ基因,构建重组表达质粒FⅦ-pOptiVEC,酶切、测序鉴定.脂质体法将FⅦ-pOptiVEC质粒转入CHO/DG44细胞,并用氨甲喋呤(MTX)进行分级加压筛选,获得高表达重组FⅦ蛋白的阳性细胞克隆.亲和层析法纯化FⅦ,并通过Western-blot检测蛋白表达情况.采用FⅦ促凝活性检测试剂盒(凝固法)检测FⅦ的凝血活性.结果表明筛选出的细胞克隆能稳定表达目的蛋白,MTX加压使其表达量明显升高.促凝活性检测结果证明获得的FⅦ蛋白具有凝血活性.     

尖吻蝮蛇毒抗凝血因子Ⅰ与活化凝血因子Ⅹ的结合特性

皖南尖吻蝮蛇毒抗凝血因子Ⅰ在抗凝血反应中存在一临界浓度(12 nmol/L), 只有在高于其临界浓度时, 才表现出显著的抗凝血活性. 用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法, 发现抗凝血因子Ⅰ与活化凝血因子Ⅹ在钙离子作用下形成1:1的复合物, 从而延长凝血时间. 天然抗凝血因子Ⅰ和脱钙抗凝血因子Ⅰ在没有钙离子存在条件下均不能与活化凝血因子Ⅹ形成复合物. 锶离子也可以使二者结合, 而钡离子和铽离子均不能使两者结合. 抗凝血因子Ⅰ是凝血因子Ⅸ或凝血因子Ⅹ结合蛋白家族中一个新发现的成员, 其分子量为29 603.6 u, 分子中两条肽链分子量十分接近, 约为14.7 ku. 抗凝血因子Ⅰ是由251个氨基酸残基组成的, 其氨基酸组成与这一家族中其他成员十分相似.     

水稻抗白叶枯病基因Xa—4的精细定位及其共分离分子标记

利用Ｘａ－４的近等基因系ＩＲ２４和ＩＲＢＢ４构建Ｆ２群体,通过抗性鉴定筛选出感病植株,利用水稻高密度图谱上的分子标记和候选抗病基因片段进行分析,构建了抗白叶枯病基因Ｘａ－４的遗传图谱,并获得了与Ｘａ－４共分离的分子标记ＲＳ１３。构建的遗传图谱还包含另外５个紧密边锁的分子标记,其中 １个是ＰＣＲ标记,４个是国际通用的水稻高密度图谱上的ＲＦＬＰ标记。为图位克隆Ｘａ－４打下的基础,也为分子标记辅助选择育     

电击法转移含人凝血因子Ⅸ基因重组质粒的影响因素

反转录病毒载体在基因治疗中可能会产生野生型病毒而引起安全性问题，本文研究含ＦＩＸｃＤＮＡ重组质粒基因治疗血友病Ｂ的可能，构建了不具反转录病毒载体结构的两重组质粒ｐＳＣＩＸＴＮ和ｐＣＩＸＴＮ，前者含ＳＶ４０早期启动子和ｈＣＭＶ启动子共同控制的ＦＩＸ ｃＤＮＡ，后者仅含ｈＣＭＶ启动子控制的ＦＩＸｃＤＮＡ，它们都含有ＴＫ启动子驱动的ｎｅｏ基因，通过电击法将基因转移到ＰＡ３１７和ＨＴ１０８０细胞，在ＨＴ１     

人凝血Ⅸ因子乳腺生物反应器的研制

为了建立人凝血Ⅸ因子乳腺生物反应器,以ＭＣＫ增强子,β－ａｃｔｉｎ启动子控制ｈＦＩＸ小基因表达顺序,反向插入Ｇ１Ｎａ框架,构建复制缺陷反转录病毒载本,并制备重组反围录病毒颗粒;     

降低血友病A发病率的干预模式

血友病A(hemophiliaA，HA)是一种最常见的X连锁隐性遗传性出血性疾病，最大的特点是自发性或轻微外伤后出血不止，严重威胁着患者的生命，目前尚无根治疗法，只能输注凝血因子VⅢ(factor vⅢ，FVⅢ)治疗和预防出血，为此开展HA诊断和产前诊断，建立HA网络，采取干预措施，是降低HA发病率、提高我国出生人口素质的主要对策。     

产科DIC18例分析

产科弥漫性血管内凝血(DIC)是由多种疾病引发的血管内凝血的病理过程。起病急剧，病势凶险。母婴死亡率为孕产妇之首。迅速补充血容量，纠正循环衰竭，保证重要脏器血流灌注，应输新鲜血、补充血小板及凝血因子，是抢救DIC休克重要措施。