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A 559 base pair fragment of cDNA locating at the putative E2 region of GBV-C/HGV was in-serted into Pichia pastoris expression vector pPICgK in the reading frame of α-factor secreting signal pep-tide. The recombinant expression plasmid pPIC9K-E2 was introduced into P. pastoris GSll5 with electro-poration and recombined with the host genome by homological recombination. The His+Mut+ recombinantyeasts were selected and cultivated in the BMMY medium. After 3 days induction with 0. 5% methanol,the target protein(E2) accumulated up to 30% of total proteins in the supernatant. The expressed E2 pro-tein was proved possessing antigenicity and high specificity with Western blot and ELISA probed with serafrom the immunized rabbits and the patients infected by GBV-C/HGV. 相似文献
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郑怡 《福建师范大学学报(自然科学版)》1998,(4)
脆江蓠营养细胞超微结构观察结果表明:营养细胞每一色素体内含有一条围周类囊体、4~10条平行类囊体和一些质体小球.平行类囊体数目与细胞所处的部位有关.内质网呈环形片层结构.同心圆膜状体具有1或2个核心.色素体在末端进行分裂,分裂时平行类囊体数目增多.幼色素体被膜直接内陷形成平行类囊体.以后发育出围周类囊. 相似文献
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重组肠激酶在甲醇酵母中高效表达的培养条件研究 总被引:1,自引:0,他引:1
对重组肠激酶在甲醇酵母中高效表达的发酵条件进行了优化,并在BiofloⅢ发酵罐中实现了高密度培养和高效表达。结果表明;温度30C,培养基pH6.0,当酵母密度达到200A600mm以上时,加入无水甲醇,控制甲醇的流加体积,使其终体积分数为1.0%~3.O%,继续诱导培养72h左右,酵母菌密度可达到150g/L,重组肠激酶总活性可达58kIU/L发酵液。 相似文献
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重组人巨细胞病毒(HCMV)嵌合肽在毕赤酵母中的表达 总被引:2,自引:1,他引:2
目的:在巴期德毕赤酵母中表达人巨细胞病毒gp52C末端和pp150C末端串联片段的嵌合肽,方法:用SacI和BglⅡ分别酶切CMVp-pPIC9K重组质粒,电打孔法导入毕赤酵母GS115后,在缺组氨酸的MD板上筛选出转化子,然后根据甲醇利用快速型(Mut^ )和甲醇利用缓慢型(Mut^s)菌株的不同生长特点,筛选出Mut^ 和Mut^s型转化子,用PCR法进一步鉴定阳性克隆,分别用甲醇诱导Mut^ 和Mut^s型转化子表达目的蛋白4d,取培养产物冻干浓缩,进行SDS-PAGE和Western blotting,筛选出能特异表达目的的蛋白的菌株,分析蛋白的含量及纯度。结果:重组人巨细胞病毒可在甲醇利用快速型毕赤酵母中有效表达,其表达量约占培养上清分泌蛋白的76.5%,结论:重组人巨细胞病毒(HCMV)嵌合肽可在真核细胞毕赤酵母中成功表达。 相似文献
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重组人源性抗HBsAg Fab抗体的特性分析 总被引:2,自引:0,他引:2
通过噬菌体展示技术从含高滴度抗乙肝表面抗原(HBsAg)抗体的人外周血淋巴细胞获得抗HBsAg Fab抗体的轻、重链基因.将Fab的轻、重链基因分别整合到巴斯德毕赤酵母(Pichua pastons)GS115菌株的染色体上,成功构建了高效分泌表达抗HBsAg Fab抗体的酵母工程菌.对酵母表达的重组Fab抗体进行了纯化,并对其相对分子质量、糖基化以及抗原结合能力等特性进行了分析,结果显示重组酵母分泌表达的重组人源性抗HBsAg Fab是一个相对分子质量为50000左右的低糖基化糖蛋白,1mg重组Fab抗体相当于40u的抗乙肝表面抗原抗体(20U/mg).表明重组Fab抗体具有较强的结合HBsAg的能力. 相似文献
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分泌性表达人rPA毕赤酵母工程菌株的构建及发酵条件的初步优化 总被引:2,自引:0,他引:2
通过PCR扩增得到组织型纤溶酶原激活剂突变体Reteplase(rPA)基因片断,将该基因片断插入到含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列载体pPIC9K中,构建了重组表达质粒pPICgK/rPA,转化Pichia pastoris GS115宿主菌.通过比较转化子在MM和MD平板上的生长状况,筛选His^ Mut^s表型转化子.并在2.0mg/mL G418平板筛选得到多拷贝转化子GR10,GR11.摇瓶培养,甲醇诱导外源基因表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析,结果表明重组蛋白分子量约39ku,能与特异性单克隆抗体发生免疫反应;体外气泡法测定rPA活性,结果显示重组蛋白具有较好的纤溶活性.通过正交试验,优化发酵条件,表达活性最高为1050IU/mL. 相似文献
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根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子使用偏爱性,对Escherichia coli来源的高比活植酸酶基因(appA)全面地进行密码子优化,人工合成了植酸酶基因(appA-P),并将该基因克隆到毕赤酵母诱导型分泌表达载体pHBM905A上,获得重组质粒pHBM905A-appA-P,通过PEG1000转化法将线性化的重组质粒转化毕赤酵母GS115菌株,筛选得到一个高效表达植酸酶的重组菌株GS115-appA-P,在25℃摇瓶培养168 h后酶活力达到422 U/mL,该植酸酶最适反应温度为60℃,最适反应pH为4.5,在20~50℃、pH1.0~6.0范围内较稳定. 相似文献
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本试验将能够成功表达重组人血清白蛋白(rHSA)的巴斯德毕赤酵母培养至诱导期后,流加亚硒酸钠,同时设空白对照发酵液(不加入亚硒酸钠),通过对比相同菌株在两组培养基中表达的rHSA的含硒量,判断硒能否以硒代氨基酸的形式存在于重组蛋白质中。发酵液经热处理、超滤、离子交换和丙酮沉淀等步骤后,进行Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳、X射线能量色散谱(EDX)和原子吸收分析。结果表明,加硒发酵液样品中硒元素的质量分数比对照多23.2%,硒与蛋白质的质量比为0.0069,高于对照发酵液近35倍,初步证明无机硒可以被毕赤酵母同化,转化为硒代氨基酸,并形成硒代重组蛋白质。 相似文献
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甜蛋白Monellin在巴斯德毕赤氏酵母中的胞内表达 总被引:1,自引:0,他引:1
将PCR扩增得到的Monellin基因片段插入Pichia pastoris胞内表达质粒Ppic3.5k‘,然后转入Pichia pastoris SMD 1168受体菌中,用G418筛选高拷贝菌株,并进一步对其进行PCR鉴定,获得的阳性克隆菌株经甲醇诱导60h,SDS-PAGE结果显示菌株破壁液中含有表达的Monellin,其大小约为11ku,并具有甜度。 相似文献