Cloning and expression of HIV-1 p24 gene in insect cells by using BAC-TO-BAC system

Recombinant transposing vector pFHIV24 was constructed by cloning the HIV-1 p24 gene into the Multiple cloning site (MCS) of the transposing vector pFastBac1 in the correct orientation with respect to the polyhedrin promoter. Recombinant bacmid bHIV24 was obtained by transposing a mini-att Tn7 element from the recombinant pFHIV24 to the mini-att Tn7 attachment site on the bacmid by Tn7 transposition functions provided by the helper plasmid. Minipreparation of recombinant bacmid DNA was transfected intoSpodoptera frugiperda (Sf9) cells to get the recombinant virus. Fresh insect Sf9 cells were infected with the recombinant virus containing p24 to express the target protein. The target protein expressed was analyzed on a 15% polyacrylamide gels and then used as antigen to check HIV-1 positive serum by ELISA. Our positive result shows that the expressed p24 protein could be used as standard antigen for HIV-1 diagnosis by ELISA and other reliable diagnostic methods of HIV-1 infection. Supported by the World Bank Boan Program Mallam Nock Joshua: born in 1967, Master of Science To whom correspondence should be addressed (027-7882712-2938)     

重组PAI—2基因在NIH3T3细胞中的活性表达

构建了人ＰＡＩ—２ｃＤＮＡ睥达质粒，以ＮＩＨ３Ｔ３为转染宿主细胞，ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ，ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ和ＰＡＩ活性扩散试验结果表明人ＰＡＩ—２ｃＤＮＡ可以在ＮＩＨ３Ｔ３细胞中正确表达出ＰＡＩ—２蛋白，且具有抑制ＰＡ的活性，同时未能检测到ＮＩＨ３Ｔ３细胞表达ＰＡＩ—２蛋白质．为探讨ＰＡ—ＰＡＩ—２系统的调控机制打下基础．     

亮氨酸拉链结构蛋白基因表达载体选择

以ZG1( )、ZG1(-)、ZG2( )、ZG2(-)、ZG3( )、ZG3(-)寡聚核苷酸片段为材料，合成了含有GCN4亮氨酸拉链蛋白基区结合DNA必需的35个氨基酸的折叠片段，将此片段分别克隆到pET3b质粒和pBLZ质粒中．酶切后用2％琼脂糖电泳检测证明两者克隆成功．将这2种重组质粒分别转化到E.coli DH5a中．发现pET3b重组体在E．coli DH5a中表达成功．而pBLZ质粒重组体在E．coli DH5a中不能成功表达；从转化子中分离得到重组质粒pET3b,酶切和序到分析都证明插入序列为合成的亮氨酸拉链蛋白基因．     

南瓜甘油—3—磷酸转酰酶基因cDNA的克隆及限制性图谱分析

依据国外有关文献,采用ＲＴ－ＰＣＲ技术成功地从南瓜子叶中分离了甘油－３－磷酸酰基转移酶（ＧＰＡＴ）基因的ｃＤＮＡ片段并克隆到了ｐＧＥＭ－Ｔ载体系统的多克隆位点上．限制性内切酶分析表明确属该基因．ＧＰＡＴ对植物的抗冷性有着重要的作用,该基因的克隆为进一步研究该酶和该基因及其与植物抗冷性关系迈出了第一步     

五指山小型猪PMSA6基因cDNA克隆及生物信息学分析

为了对海南五指山小型猪蛋白酶体亚基α型6（proteasome subunit alpha type 6,PMSA6）cDNA基因进行克隆和生物信息学分析,笔者以构建的五指山小型猪外周血白细胞cDNA文库为材料,采用菌落PCR方法,克隆得到PMSA6全长cDNA,并向GenBank递交了该序列（登录号：FJ358606）．同时运用生物信息学软件对该基因核苷酸序列进行了分析,并预测了其编码蛋白的理化性质及二级结构等．生物信息学分析表明：该cDNA全长1029bp,5’非翻译区长96bp,3’非翻译区长192bp,含有一个741bp完整的开放阅读框,编码246个氨基酸．该蛋白的分子量为37．680kD,等电点为8．76．进一步比对分析发现,五指山小型猪PMSA6基因的核酸序列及其氨基酸序列与人、牛等哺乳动物具有很高的相似性．本研究成功克隆了海南五指山小型猪P肛SA6基因cDNA,并进行了相关生物信息学分析,为进一步研究PMSA6在动物体内的作用机理奠定了基础．     

中国白兔IL-6基因的分子克隆及其表达研究

运用RT-PCR技术对用ConA刺激的中国白兔外周血淋巴细胞(PMBCr)进行了扩增,将纯化后的PCR产物克隆入pMD18-T中进行核苷酸序列测定.结果中国白兔IL-6基因全长726 bp,编码242个氨基酸,其中前26个氨基酸残基构成信号肽序列.与不同物种IL-6基因相比,核苷酸和推导的氨基酸序列有一定的差异.在推导的中国白兔IL-6氨基酸序列中,在108-110位存在1个潜在的N-联糖基化位点,同时存在9个Cys残基.将pTIL-6双酶切,回收目的基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中构建了重组质粒pETIL-6,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG进行了诱导.结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为29.5kDa的重组目的蛋白.经凝胶薄层扫描,目的蛋白表达量可占菌体蛋白的16.2%.     

Shewanella piezotolerans WP3中sulfotransferase基因的克隆表达与活性研究

Shewanella piezotolerans WP3分离自西太平洋1914 m的深海沉积物中,是一株革兰氏阴性,耐冷、耐压且兼性厌氧的杆状细菌.初步研究证明海洋细菌中含有磺基转移酶(sulfotransferase,ST)活性.本实验中构建了WP3两个磺基转移酶基因的原核表达载体,在E.coli中表达并纯化了重组ST,通过底物的化学反应,证明两个重组磺基转移酶均具有转磺酶活性.研究结果为后续实验的WP3胞外寡糖的离体硫酸化修饰工作奠定了基础.     

大鼠CuZn—SOD cDNA的克隆及高效表达

采用PCR技术,扩增大鼠CuZn-SOD cDNA,双酶切后与表达载体pBV220连接,构建出表达质粒pBV-RCS,并转化大肠杆菌DH5α,经金属离子和42℃诱导,pBV-RCS得到高表达,经SDS－PAGE及薄层扫描测定表达蛋白占菌体总蛋白的49％,是目前国内外SOD高表达菌株之一^[1,2],表达蛋白以包涵体形式存在于菌体内,经超声波破壁后,再经透析复性和稀释复性,表达蛋白具有特异性SOD酶活性（1298U/mL)。α     

斜纹夜蛾核型多角体病毒日本株(C3)p10基因的克隆及序列分析

从斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodoptera litura mukieapsid nucleopolyhedrovirus，Splt MNPV)日本株(C3)基因组中克隆了p10基因．核苷酸序列分析表明，该克隆片断涵盖了318bp的读码框及5’端启动子区191bp和3’端终止区62bp的序列．在起始密码子ATG上游-63～-59bp处有一杆状病毒晚期和晚晚期启动子基序TAAG．联配分析表明，Splt MNPV日本株(C3)的核苷酸序列和氨基酸序列与其它9种核多角体病毒的同源性有较大差异．以p10基因为基础绘制的杆状病毒分子进化树将家蚕核多角体病毒(Bombyx mori nuchopolyhedrovirus，BmNPV)与苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multicapcid nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)归到同一分枝，这与以gp37基因和egt基因为基础绘制的杆状病毒分子进化树结果一致．