核移植方法和活化方法对小鼠体细胞克隆胚胎发育的影响

用卵丘细胞为核供体进行小鼠体细胞克隆, 成功获得了一批成年体细胞克隆小鼠. 为探讨不同核移植方法和重构胚活化方法对小鼠克隆胚发育的影响, 用B6D2F1小鼠的卵丘细胞和卵母细胞作为供、受体进行核移植实验, 采用电融合和细胞质内直接显微注射的方法进行核移植, 并采用电脉冲、乙醇处理、氯化锶处理和电脉冲联合氯化锶4种不同方法对重构胚进行活化, 对克隆胚胎的体外及体内发育进行研究. 结果显示, 利用显微注射法获得重构胚胎的工作效率(90.7%)显著高于融合法获得重构胚胎的工作效率(49.7%). 乙醇、电脉冲和氯化锶3种激活方法都可以诱导孤雌胚发育到囊胚, 但前二者处理的胚胎的囊胚发育率(52.4%, 54.2%)显著低于后者(76.9%). 10 mmol/L氯化锶处理6 h活化效果最好. 融合法获得的重构胚经氯化锶或者电脉冲联合氯化锶激活后, 囊胚发育率(9.5%, 8.6%)显著高于单纯电脉冲激活(2.6%), 而乙醇活化的重构胚没有发育到囊胚阶段. 用显微注射法经氯化锶激活获得的重构胚的囊胚发育率最高(16.6%). 注射法和融合法获得的重构胚胎经氯化锶激活后进行胚胎移植, 都获得了发育到期的体细胞克隆小鼠, 发育到期率分别为 2.5%和1.4%. 结果表明, 两种核移植方法对B6D2F1 小鼠重构胚胎的早期发育能力有一定影响, 用这两种方法都可以获得体细胞克隆小鼠; 不同活化方法对重构胚胎的体外发育能力有显著影响, 在上述4种激活方式中, 氯化锶处理对克隆胚的激活效果最好.     

克隆牛过程中电融合条件对附植前胚胎发育的影响

实验比较了克隆牛过程中电融合条件的改善对附植前胚胎发育的影响. 电融合强度为140 V/mm,10 μs/次时的效率要较100 V/mm,20 μs/次和180 V/mm,10 μs/次时高,可以降低融合后重构胚死亡率,提高克隆牛囊胚发育率. 施加直流电脉冲前先给予5 V交流电场预处理数秒钟,然后在电极之间通以两个直流脉冲(140 V/mm, 10 μs/次,间隔0.1 s)与不用交流电预处理对融合率和重构胚的发育率无显著差异. 另外实验比较了甘露醇和山梨醇两种融合液对融合及重构胚发育的影响,结果表明囊胚发育率差异不显著,但山梨醇较甘露醇融合液更容易操作. 实验生出的4头克隆牛存活至今.     

动物克隆研究进展

动物克隆随着"多莉"羊的诞生而逐渐受到人们的关注.动物克隆的核心是细胞核的再程序化.从动物克隆的技术流程、理论基础以及应用领域等方面作一综合论述.     

连续核移植对异种克隆大熊猫胚胎发育的影响

异种体细胞核移植为拯求濒危动物提供了一条新的途径,已有的异种核移植报道证明,经休眠处理的体细胞核在异种胞质中能完成早期发育,用处于活跃分裂的大勇猛体细胞作为供核细胞移入去核的兔卵母细胞中,经电融合（融合率为71.6%）及电活化后,体外培养获得了4.2%的囊发育率,为了改善重构胚的发育率,采用连续核移植的方法,即用处于活跃分裂的来源于大熊猫－兔异种重松胚的卵裂球作为供核细胞移入去核兔卵母细胞透明带下,共进行3次连续核移植,核移植融合率分别为79.5%,84.1%和78.0%,与体细胞核移植组无显著差异;经电活化后,体外培养的异种重构胚胎获得了显著高于体细胞核移植组的胚胎发育率,囊胚发育率分别为19.4%,13.5%和10.3%（P＜0.05）。这些结果表明,未经休眠的体细胞核也能支持异种重构胚的早期发育,连续核移植可以提高异种克隆大熊猫重构胚的发育率。     

外源基因在鱼类胚胎中表达与整合的时序

采用细胞核移植技术,以绿色荧光蛋白基因为报告基因,泥鳅为试验材料,研究了外源基因在鱼类胚胎发育过程中的表达与整合。结果表明,外源基因在鱼类胚胎中,从原肠胚期开始表达,与鱼类胚胎分化时期相吻合。转移的外源基因的表达时间与启动调控顺序有关;表达效率与基因构型有关,受体胚胎早期中未整合的环形质粒的表达效率高于线性质粒。外源基因的整合最早从囊胚期开始,并持续相当长的时间,两种不同结构的基因共转移时,其整合     

Calcium-releasing activity induced by nuclei of mouse fertilized early embryos

At fertilization,repectitive transient rises of intracellular calcium concentration occur in all mammals studied so far .It has been shown that calcium rises could be induced when mouse fertilized 1-,2-cell nuclei were trans-planted into unfertilized eggs and that the reconstituted embryo could be activated .Howerver,whecther the capability of inducing calcium rises occurs in all stages of mammalian embryos remains unknown ,In this study ,by using the nuclear transplantation technique and measurement of intracellular calcium rises in living cells,we showed that only the nuclei from mouse fertilized 1-cell and 2-cell embryos ,neither the nuclei from 4-,8-cell and ethanol activated parthe-nogenetic embryos nor 2 or 3 nuclei of electrofused 4-cell stage syncytium ,have calcium -releasing activity when they were transferred into unfertilized mature oocytes,Our results indicate that the calcium-releasing activity in nuclei of 1-,2-cell embryos is produced during fertilization and exists at the special stage of fertilized early embryos.These sug-gested that the capacity of inducting calcium release activity in fertilized early embryos is important for normal embryonic development.     

兔桑椹胚胎细胞周期同步化及核移植后的发育能力

进一步改进兔供体桑椹胚Ｇ１期可逆性同步化方法，并比较Ｇ１期核移植胚胎和未同步化核移植胚胎在体内的发育能力。将兔早期１６细胞胚用秋水仙胺和ａｐｈｉｄｉｃｏｌｉｎ处理适当时间，这时期胚胎细胞处于３２细胞期的Ｇ１期。经扫描显微分光光度法测定表明，没有ＤＮＡ合成。经两种药物同步化处理，胚胎正常细胞周期、分裂及移植前发育均不受影响。与用未同步化３２细胞胚细胞核移植相比，用同步在Ｇ１期胚胎细胞进行核移植后，显     

牛卵母细胞不同时间的成熟培养可提高核移植效率

：比较了成熟培养不同时间的卵母细胞的成熟率、去核率及用于核移植的效率,认为成熟培养21 h的卵母细胞虽然有较高的成熟率,但不适于采用盲去法去核.成熟培养19 h的卵母细胞核移植效率略高于成熟培养17 h.因此认为采用盲去法去核操作大批卵母细胞时,19 h的体外成熟培养时间是比较适宜的.     

人类体细胞克隆胚的构建

人类体细胞克隆胚的构建是治疗性克隆的基础和前提. 将供体细胞核注射到成熟卵母细胞, 然后用钙离子载体(A23187)和6-甲基氨基嘌呤(6-DMAP)激活卵母细胞. 在卵母细胞活化并出现原核样核(2PN)后, 去掉雌原核而保留供体细胞核, 避免了去核时对卵母细胞进行DNA荧光染色和紫外线照射, 同时也避免了去除过多的细胞质. 经体外培养后, 有少量核移植胚发育到囊胚阶段.