HSV-1的microRNA-LAT基因修饰人骨髓间充质干细胞的体外研究

人骨髓间充质干细胞(HMSCs)具有强大的多向分化潜能, 能为组织移植和体外基因传递载体. 单纯疱疹病毒1型(HSV-1)不仅具有嗜神经元性, 而且对HMSCs也具有很强亲嗜性, 可作为HMSCs的基因修饰载体, 主要通过其自身携带的microRNA-LAT发挥抑制凋亡作用. 本研究构建针对microRNA-LAT的特异性茎环结构的逆转录引物, 并用特殊探针的real-time RT-PCR方法检测HMSCs细胞质中成熟microRNA-LAT的相对定量水平. 采用顺铂诱导对照法观察HSV-1对HMSCs的作用. 通过观察HMSCs细胞形态和流式细胞仪检测细胞凋亡率, 评测HSV-1引起的HMSCs抗凋亡功能; 同时采用RNAi方法, 化学合成TGF-β信号传导通路中SMAD3及TGF-β1靶点的siRNA和microRNA- LAT siRNA. 从基因mRNA, microRNA和蛋白质水平, 分别采用RT-PCR, real-time RT-PCR和Western blotting方法, 检测HMSCs中microRNA-LAT和SMAD3及TGF-β1表达水平及其相互关系. 结果表明, 与单纯顺铂诱导对照组相比, HSV-1组和microRNA- LAT组HMSCs凋亡细胞数减少, 细胞凋亡率降低(P < 0.05), 具有抗凋亡作用; 在TGF-β信号传导通路中, HSV-1组和microRNA-LAT组TGF-β1与 SMAD3靶点基因在mRNA水平及蛋白水平的表达量均观察到一定程度降低, 且降低水平与采用RNAi法的SMAD3组和TGF-β1组相类似. Real-time RT-PCR结果显示, 与空白对照组相比, 顺铂组HMSCs细胞质中成熟microRNA-LAT mRNA水平有所降低(P < 0.05). 据此, HSV-1 及其microRNA-LAT可敲除SMAD3和TGF-β1基因, 下调TGF-β信号传导通路表达而对顺铂诱导的HMSCs凋亡有拮抗作用. 本研究结果证明, HSV-1自身携带的microRNA-LAT对HMSCs细胞TGF-β信号传导通路中的SMAD3和TGF-β1具有精细调节和基因修饰作用, 使HMSCs具有抗凋亡功能, 并且HSV-1可作为针对HMSCs的特殊基因修饰候选载体.     

单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ半巢式PCR检测方法的建立和在病毒性脑炎诊断中的应用

为进一步提高 PCR诊断方法的特异性和敏感性 ,在单纯疱疹病毒 ( HSV) TK基因区设计了一对外层公用引物和两个内层分型引物 ,建立了半巢式 PCR检测和分型 HSV的方法。用该方法检测了天津地区 64例病毒性脑炎患者 (病脑组 )和 4 6例其他中枢神经系统疾病患者 (对照组 )的脑脊液 ( CSF)标本。病脑组了阳性率为 1 5.63% ( 1 0 / 64) ,其中 9例为 HSV-1感染 ,1例为 HSV-2感染。对照组阳性率为 2 .1 7% ( 1 / 46)。本方法在发病后第 1天即可测出 CSF中的 HSV DNA,敏感性为 0 .0 1 TCID50 。     

Kaposi＇s sarcoma-associated herpesvirus. Towards better understanding of its latency and pathogenesis

Kaposi＇s sarcoma-associated herpesvirus （KSHV） is a double stranded DNA virus. It was found to be related to Kaposi＇s sarcoma （KS）, primary effusion lymphoma （PEL） and multicentric Castleman＇s disease （MCD）, which cause severe illness in AIDS patients. As a member of human herpesvirus family, KSHV displays two distinct phases in its life cycle, the default latent and lytic replication phase. Following primary infection, the virus can quickly establish latent infection in the host. However, it is still not fully understood up to date how KSHV establishes and maintains viral latency in the host cells. KSHV mainly infects endothelial cells in the host, promoting proliferation and angiogenesis. Abundant angiogenesis is the key feature of KS and is the critical factor for KS progression. The mechanism of KSHV mediated pathogenesis is also largely unknown. In this review, we summarize the recent progress in the mecha- nisms of KSHV latency and pathogenesis, with particular views from our work.     

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒ORF50结合蛋白的筛选

应用酵母双杂交系统,以包含RTA氮端530个氨基酸的片段插入载体pGBKT7作为诱铒,在人脾脏cDNA文库中,筛选得到4个阳性AD/文库质粒,并用酵母双杂交实验验证了阳性AD/文库质粒与RTA的相互作用.将阳性AD/文库质粒测序并对测序结果做BLAST分析,发现它们分别是:TLE2、RBP-Jk、ZNF-12和WHSC1.     

甲基-β-环湖精对人类疱疹病毒6型感染性的影响

目的了解甲基-β-环糊精对人类疱疹病毒6型包膜胆固醇含量及其病毒感染性的影响.方法用不同浓度的甲基环糊精作用于HHV-6A GS株,经20%蔗糖缓冲液梯度离心,去除甲基-β-环糊精并纯化病毒,分别进行病毒胆固醇含量的测定及感染HSB-2细胞,然后采用IFA法和免疫蛋白杂交等方法检测病毒受甲基环湖精作用后,其对靶细胞的结合、融合、进入的影响以及包膜糖蛋白的表达.结果甲基-β-环糊精能去除HHV-6A包膜胆固醇,病毒的感染性遭到了破坏,但可以被外源性胆固醇所恢复.HHV-6A结合宿主细胞的能力稍微受到影响,但其感染性及诱导细胞融合的能力显著减弱,包膜糖蛋白的表达不受影响.结论HHV-6A包膜胆固醇在细胞融合过程中起着重要作用,同时也是病毒进入宿主细胞的关键因素.     

乳腺癌特异性多肽介导生物大分子体内外效应

探讨乳腺癌特异性多肽PI携带外源性生物大分子靶向抗肿瘤的作用.将分离纯化获得的融合蛋白PI-EGFP与靶细胞MDA-MB-231体外共培养,探讨融合蛋白与靶细胞的结合能力;将此融合蛋白经尾静脉及肿瘤局部注射入荷瘤裸鼠体内,探讨其在肿瘤部位的聚集程度;利用分子克隆技术构建重组原核表达载体pET-28a(+)-pI-tk,诱导表达、分离纯化、鉴定获得的融合蛋白PI-HSV-TK,将不同浓度的融合蛋白与MDA-MB-231细胞共培养,经更昔洛韦(ganciclovir,GCV)作用后,探讨PI-HSV-tk对细胞的靶向杀伤效应.荧光显微镜下观察,在靶细胞内可检测到绿色荧光信号,经尾静脉及局部注射融合蛋白PI-EGFP后,在不同组织器官可见不同强度的荧光信号,在尾静脉注射组的肾脏和肿瘤部位可检测到荧光信号,而局部注射组仅在肿瘤部位可检测到;成功构建了重组原核表达载体pET-28a(+)-pI-tk;分离纯化获得高效表达的PI-TK融合蛋白,SDS-PAGE电泳及Western blotting鉴定融合蛋白的表达正确;CCK-8法及流式细胞仪检测显示,GCV对转导融合蛋白的MDA-MB-231细胞有杀伤作用,IC50值为152.64μg/mL.乳腺癌特异性转导多肽能携带生物大分子进入靶细胞,并携带具有杀伤效应的物质,使其发挥靶向治疗作用,为进一步探讨该多肽作为靶向性载体奠定实验基础和理论依据.     

猫疱疹病毒Ⅰ型的分离与鉴定

目的从临床疑似猫病毒性鼻气管炎的病例中分离猫疱疹病毒Ⅰ型。方法用猫肾细胞(FK-81)对临床疑似猫病毒性鼻气管炎病猫的眼鼻分泌物进行分离培养,连续传4代,对获得的培养物进行了电子显微镜观察、血凝试验、病毒核酸型试验、理化特性试验以及PCR扩增和扩增产物基因测序鉴定。结果该病毒粒子呈球形,直径为160 nm左右,有囊膜。凝集猫红细胞,不凝集猪、兔、犬、小鼠和鸡的红细胞。病毒对乙醚、酸、热、胰蛋白酶敏感,其核酸型属DNA。PCR扩增为猫疱疹病毒Ⅰ型阳性,扩增产物基因序列与Nunberg等报道猫疱疹病毒Ⅰ型的基因序列同源性为100%(登录号:M26660)。结论在国内首次成功分离一株猫疱疹病毒Ⅰ型,其形态、血凝性、理化特性、基因序列等与国外文献报道一致,为猫病毒性鼻气管炎病原学、疫苗免疫、诊断及分子生物学研究奠定基础。     

深圳市男男性行为者HIV、梅毒及单纯疱疹病毒2型的感染现状及其影响因素

目的 了解深圳市男男性行为者(men who have sex with men,MSM)HIV、梅毒及单纯疱疹病毒2型(herpes simplex type 2 virus,HSV-2)的流行特征,为深圳市男男性行为人群艾滋病以及其他性病的防控提供依据.方法 采用时间场所抽样方法招募2018年5月18日至12月29...