肥厚性疤痕成纤维细胞的基因芯片分析

用基因芯片分析肥厚性疤痕与正常皮肤成纤维细胞在静息及TGF－beta3刺激下的表达谱的改变,正常成纤维细胞在TGF－beta3刺激前后的表达谱与肥厚性疤痕成纤维细胞在TGF－beta3刺激前的表达谱正相关（r=0.76037),刺激后2种成纤维细胞的表达差异与肥厚性疤痕成纤维细胞TGF－beta3刺激前后的表达谱差异正相关（r=0.826 762),构成以上差异的基因有620条,涉及细胞骨架蛋白,细胞周期蛋白,细胞因子,受体,转录因子及糖,蛋白质和酸代谢的酶类,未发现胶原蛋白I,III的表达水平的改变,结果提示：1,肥厚性疤痕成纤维细胞在静息状态下表现出与正常细胞受TGF－beta3刺激后相似的反应,其可能处于一种应激状态;2．TGF－beta3刺激后2种细胞的反应差异与肥厚性疤痕细胞的异常反应相关,TGF－beta3的作用背景可能是肥厚性疤痕的分子病理学基因之一,3．基因表达变化涉及细胞因子,细胞周期调控,凋亡等,其具备疾病遗传异质性的分子基础。4．胶原表达无明显上升,提示在肥厚性疤痕发病中,胶原纤维及细胞外基质堆积有复杂的分子生物学基础。     

大鼠脑损伤后海马GAP-43 mRNA水平的变化

以DIG（Digoxigenin）标记的GAP-43 cDNA片段为探针,使用原位杂交方法,检测了大鼠皮层硬性脑挫伤后GAP-43 mRNA水平的变化。结果表明：海马CA3、CA1和DG区的GAP-43 mRNA水平在损伤后48h明显升高,其中CA3区变化最甚,而且伤侧比对侧显著。1周和2周后表达仍维持较高水平,但不如48h的高,这显示表达的峰值在1周之内。上述结果为研究脑损伤后生理及机能代偿的修复机制提供了有意义的信息。     

黑曲霉葡萄糖淀粉酶cDNA的克隆和序列分析及其在大肠杆菌中的表达(英文)

以poly(A)~ mRNA为模板,噬菌体λgt 10 DNA为载体构建了黑曲霉3758的cDNA的文库。用编码黑曲霉葡萄糖淀粉酶329—418位氨基酸的DNA顺序(456bp)作探针从该文库中筛选葡萄糖淀粉酶cDNA。采用原位噬菌斑杂交法获得11个阳性噬菌斑,从其中6个噬菌体中提取DNA进行限制酶切分析和印迹法转移杂交试验,发现这些阳性噬菌体DNA含有不同大小的插入片段,它们都能与DNA探针杂交,表明已克隆了葡萄糖淀粉酶的cDNA。采用单酶切及交叉双酶切法制定了2.1kbcDNA的物理图并对2.1kb片段作了全序列分析。序列分析结果显示,克隆的2.1kb片段含5＇端非编码区,编码葡萄糖淀粉酶的结构基因及3＇端非编码区。克隆的cDNA片段转移至表达载体λgt11,感染大肠杆菌后,产生的噬菌斑转移硝酸纤维素滤膜后与~(125)I标记的抗葡萄糖淀粉酶抗体进行免疫反应,结果证明含2.1kbcDNA的λgt11表现葡萄糖淀粉酶阳性.2.1kb片段也曾转至质粒pPL2,转化大肠杆菌JF1125。细胞裂解物在SDS-PAGE电泳中可看到新的蛋白带。这些结果表明,克隆的黑曲霉葡萄糖淀粉酶cDNA可以在大肠杆菌中表达。     

类硫氧还蛋白hTRXLⅠ cDNA的克隆和原核表达

从人18周胎脑中抽提mRNA,建立cDNA文库,通过大规模测序克隆出一条人类基因,该基因全长1644bp,开放阅读框1146bp,编码一个含372个氨基酸的蛋白,预测分子质量约为46.8ku.经与蛋白数据库比较,发现具有人硫氧还蛋白结构,命名为人的类硫氧还蛋白基因Ⅰ(human Thioredoxin like geneⅠ,hTRXLⅠ).多组织膜Northern blot结果显示在心脏、脑、胎盘、肝、骨骼肌、肾、胰腺等各个组织中均有表达,肺中表达不明显.通过Unigene染色体定位,将hTRXLⅠ定位于11q11,把hTRXLⅠ的读框克隆入经改造的PBV220质粒中,在E.coli中诱导后获得表达.     

人B淋巴细胞刺激因子的真核表达以及表达条件的筛选

采用基因克隆、重组等方法，将人B淋巴细胞刺激因子（hsBLyS）基因从人胎盘cDNA文库中克隆出来，测序鉴定后得组构建成真核表达载体pcDNA3．1( )hsBLyS，然后用磷酸钙法和脂质体法分别转染真核宿主细胞COS－7，并在其中表达48h、36h、72h、96h；表达细胞经超声处理后离心，上清进行SDS－PAGE鉴定，结果表明：对于hsBLyS来说，磷酸钙法比脂质体法转染效果好，而且对于磷酸钙法，表达量是72h达到最高。     

用加端PCR技术改造h－IGF－1cDNA

用ＤＮＡ合成仪合成了分别带有ＰｓｔＩ位点和ＳａｌＩ位点及终止密码子的２个用于扩增ｈＩＧＦ－１ｃＤＮＡ的ＰＣＲ引物．利用合成的引物，７００ｂｐ长的ｈＩＧＦ－１ｃＤＮＡ模板和Ｔａｑ聚合酶进行ＰＣＲ扩增．扩增产物经电泳鉴定后克隆进Ｍ１３ｍｐ１８载体，进行核苷酸序列分析．结果显示：ＰＣＲ产物含已发表的ｈＩＧＦ－１成熟蛋白的编码序列和５＇端的ＰＳｔＩ位点及３＇端的ＳａｉＩ位点及终止密码ＴＡＧ．用加端ＰＣＲ技术成功地扩增和改造了ｈＩＧＦ－１的编码序列．     

穿山龙液泡H+-ATPase c亚基基因片段的克隆

利用抑制消减杂交（SSH）和SMART技术，构建了3年生和1年生穿山龙（Dioscorea nipponica）根组织mRNA群体间正向差减cDNA文库．从34个随机测序的cDNA克隆中，发现了1个编码液泡H^＋-ATPase（V-H^＋-ATPase）c亚基的克隆，并命名为DnvHAc1（Accession No：DN792564）．序列同源性分析表明，其cDNA序列长486bp，3’端具有PolyA结构，其编码的氨基酸序列（115个氨基酸残基）也与多种植物的液泡H^＋-ATPase c亚基（16kDa proteolipids）具有较高同源性，具有3个跨膜疏水结构域，结构域Ⅲ为功能保守的区域，有dicyclohexylcarbodimide（DCCD）结合位点，Glu-92在调节液泡H^＋-ATPase具有重要作用．该研究结果为克隆其全长基因和进一步研究其在薯蓣皂甙次生代谢生物合成中的功能提供了重要的实验基础．     

Cloning of a novel phosphateserine aminotransferase gene from a Triticum aestivum-Elytrigia elongatum alien substitution line with resistance to powdery mildew

Shannong 551, a T. aestivum-E, elongatum alien substitution line with resistance to powdery mildew, was inoculated with pathogenic spores of powdery mildew. The leaf samples were prepared 48 h after inoculation for scanning electron microscopy. The result showed that germination of spores and growth of young mycelia on leaves of Shannong 551 were suppressed at the early stage of infection. At the same time, RNAs were prepared from the leaves for the cloning of WRP1 and RPW2 by cDNA RDA and RACE technology. BLAST analysis of the sequences indicated that both WRP1 and RPW2 were novel genes. WRPI contains no complete ORE RPW2 contains the conserved structure domain of aminotransferase, and its DNA sequence shares high homology with genes of phosphateserine aminotransferase in many organisms. Therefore, it is speculated as a novel phosphateserine aminotransferase gene. The results of Northern blot suggested that expression of RPW2 occurred at the early stage of infection by powdery mildew. Southern blot using the probe of RPW2, in which there was strong hybridizing signals in both genome of Shannong 551 and E. elongatum, but not in those of Jinan 13 and Lumai No.5, indicated that RPW2 derived from the genome of E. elongatum.     

感染性嵌合病毒SHIV cDNA的构建及活性筛选

以感染性克隆SHIV-KB9 cDNA为主要骨架，将其env基因区域的gp120和部分gp41(从N末端的50到650个氨基酸)的1．7kb片段，用来源于4个不同中国HIV-1 B’／C毒株env的相应区域进行替换，构建了50个全基因SHIV cDNA克隆，大规模体外活性筛选实验，获得了能够在人的PBMC中进行生产性复制的SHIV-XJ02170 cDNA克隆．