重组人表皮生长因子在毕赤酵母中的表达纯化及鉴定

构建并筛选出重组人表皮生长因子(rhEGF)高表达的毕赤酵母(Pichia pastoris)基因工程菌株,于30L发酵罐进行中试发酵按1∶15接种15LFBSM发酵,pH 6.0、28~30℃、DO20%~30%、流加甲醇诱导发酵42h,rhEGF的表达量可达1g/L.采用疏水层析、离子交换柱层析及分子筛凝胶层析的方法分离纯化rhEGF,获得的rhEGF试制品的纯度大于95%,得率在40%以上.通过基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)测定rhEGF的分子质量为5 946.309u,与理论分子质量一致.N端蛋白序列分析仪分析其N端氨基酸序列,测序结果与理论的氨基酸序列一致.采用Balb/c 3T3细胞增殖/MTT比色法测定其活性,测定rhEGF的活性为1.0×106 IU/mg,与WHO标准品相当.本研究实现了毕赤酵母高效表达rhEGF并纯化得到符合《中国药典》标准的rhEGF,为工业化生产rhEGF提供基础.     

家猪BMP-2、BMP-3基因克隆及其组织表达探究

本研究以长白猪(Landrace)肺cDNA为模板,扩增获得猪骨形态发生蛋白BMP-2和BMP-3基因的cDNA全长.BMP-2基因cDNA全长为1742bp,编码395个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、绵羊、大鼠、小鼠等的BMP-2基因的氨基酸序列一致性分别94.18%,95.4%,95.2%,90.3%,90.60%;BMP-3基因cDNA全长为1639bp,编码475个氨基酸的前体蛋白,猪与人、牛、绵羊、大鼠、小鼠等的BMP-3氨基酸序列的一致性分别是84.7%、87.7%、82.3%、80.4%、79.5%.采用RT-PCR方法,对BMP-2、3基因在家猪主要组织的表达进行探究.结果显示:BMP-2在所有组织中均有表达;而BMP-3在脑、肺、小肠中表达量较高,其他组织中表达量弱.     

猪Akt1、Akt2基因克隆与组织表达图谱分析

为了得到长白猪蛋白激酶Akt1和Akt2基因序列并分析其表达模式,本研究使用RT-PCR方法,首先克隆了蛋白激酶Akt1和Akt2的cDNA.序列分析显示:长白猪Akt1基因的cDNA全长1461bp,编码具480个氨基酸残基的前体蛋白,其氨基酸序列与人,牛,大鼠,小鼠同源性达到97%以上.长白猪Akt2基因cDNA全长为1505bp,编码具481个氨基酸残基的前体蛋白,其氨基酸序列与人,牛,大鼠,小鼠的同源性高达97%以上.SMART分析表明,猪Akt1和Akt2蛋白均包含了与PI-3K结合的PH结构域及2个具有丝氨酸/苏氨酸激酶催化活性的S_TKc结构域.RT-PCR检测结果显示:Akt1mRNA在垂体、心脏、肝脏、脾脏、肌肉组织中高表达,在大脑、小脑、肾脏表达丰度较低.Akt2则在小脑、垂体、心脏、肝脏、脾脏和肌肉组织中高表达,而在大脑和肾脏中表达丰度较低.     

甘薯HXK基因的克隆、组织表达及生物信息分析

通过RT-PCR技术从甘薯的总RNA中克隆得到了全长的己糖激酶基因,测序结果表明HXK(hexokinase)基因编码区长1491bp,编码496个氨基酸,其翻译的蛋白质分子量为53.4kD,其氨基酸序列与其它已知高等植物HXK基因具有很高的同源性.构建了原核表达载体pET-HXK,经IPTG诱导后可表达获得相对分子量约为71kD的外源融合蛋白,与预测结果一致.并对HXK基因在不同组织中的转录水平进行了数字表达谱和荧光定量分析.     

过表达hsa-miR-145对人恶性多发性畸胎瘤细胞增殖凋亡的影响

通过构建hsa-miR-145的重组体pGenesil-1-miR-145,并瞬时转染到人恶性多发性畸胎瘤细胞(NTERA-2)后,利用qRT-PCR法检测hsa-miR-145,以及肿瘤发生相关基因OCT4,SOX2,c-Myc,KLF4,FSCN1在转录水平的表达差异;同时利用MTT法和流式细胞术Annexin V-APC/7-AAD双染法检测hsa-miR-145对NTERA-2细胞增殖的生物学效应和细胞凋亡的影响.结果表明:hsa-miR-145的高表达导致NTERA-2细胞增殖明显减弱,凋亡率增加;转染重组质粒hsa-miR-145后,OCT4,SOX2,c-Myc,FSCN1基因的表达量均有所降低,提示miR-145的过表达可能通过抑制靶基因的表达从而影响生殖肿瘤细胞的生物学功能.     

一个麻疯树C2H2型锌指蛋白基因JcZFP1的克隆与表达分析

从麻疯树胚乳cDNA文库中克隆得到一个C2H2型锌指蛋白基因,JcZFP1,全长931bp,开放阅读框全长735bp,编码244个氨基酸残基,等电点pI=7.0,分子量PA=27.38kD.C2H2型锌指结构位于第81至103个氨基酸残基中,包括植物锌指蛋白特有的保守氨基酸序列QALGGH.在该基因的顺式作用元件上发现了与生长发育和逆境胁迫相关的启动元件.荧光定量PCR(qPCR)检测发现,JcZFP1基因在麻疯树各器官中的表达量依次为:绿果皮花叶根茎种仁,且幼嫩器官表达量高于成熟器官;对麻疯树幼苗进行低温、干旱胁迫时,JcZFP1基因的表达量明显增加,表明该基因可能在麻疯树的生长发育及逆境胁迫应答过程中起重要作用.     

四纹豆象小分子量热激蛋白基因的鉴定与表达分析

本研究利用生物信息学方法对NCBI数据库中四纹豆象(Callosobruchus maculatus)全部热激蛋白进行分析,从中鉴定出一种中央区具有典型α-晶体蛋白质结构域的小分子量热激蛋白基因,shsp27(Gen Bank编号FK669241.1)。采用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测了四纹豆象4龄幼虫经不同温度(4、15、30、37℃以及4℃低温处理24 h后回复30℃)胁迫处理24 h后,shsp27 m RNA的相对表达量。分析结果表明,在4龄四纹豆象幼虫中,低温(4、15℃)与高温(37℃)胁迫处理后shsp27的相对表达量相对于对照组(30℃恒温培养组)均有上调响应,但对高温胁迫的响应程度略强,低温回复处理组的相对表达量也略高于对照组,但上升不显著,初步认为shsp27基因表达与四纹豆象耐寒热的适应性无直接相关性。     

含FMDV中和表位的重组病毒颗粒的构建及鉴定

针对FMDV的疫苗研究一直是防控口蹄疫的重点,而病毒样颗粒(VLPs)形式的疫苗因其安全性和近似传统灭活疫苗的良好免疫效果,近年来逐渐成为疫苗研究的一个新方向.本实验利用猪圆环病毒PCV2的衣壳蛋白(CAP)作为载体,分别插入FMDV MYA98毒株的抗原表位组合——VP1蛋白上B细胞表位141~160aa(B)与串联的B细胞和T细胞表位141~160aa-21~40aa-141~160aa(BTB),构建对应重组杆状病毒,分别命名为reBAC-CAP-B,reBAC-CAP-BTB.将上述病毒颗粒转入Sf9细胞表达,收获重组杆状病毒并再次感染Sf9细胞扩大病毒滴度,获得目的蛋白CAP-B,CAP-BTB,经过SDS-PAGE,Western blot鉴定正确,透射电镜观察到20~30nm大小的目的颗粒.     

珍珠鸟和家鸡甲状旁腺激素3型受体(PTH3R)的结构与表达图谱分析

甲状旁腺激素(PTH)与动物钙稳态调控和骨代谢平衡相关,其生理作用是通过甲状旁腺激素受体(PTHR)介导。甲状旁腺激素受体家族包括三个不同的亚型,其中甲状旁腺激素3型受体(PTH3R)在非哺乳类脊椎动物生长发育过程中起着重要作用,然而PTH3R在鸟类中的研究则相对较少。 本研究采用RT-PCR方法,首先克隆了珍珠鸟和家鸡的PTH3R基因全长cDNA序列。结果显示,家鸡PTH3R (cPTH3R) cDNA全长1632 bp,编码543个氨基酸,珍珠鸟PTH3R(zPTH3R-w) cDNA序列全长1563 bp,编码520个氨基酸,其蛋白均含有信号肽序列、七次跨膜区等特征性结构。此外,在珍珠鸟中还发现一个新剪接变体zPTH3R-v1,其cDNA序列全长1468 bp,编码488个氨基酸,其缺失了第3外显子进而导致第1跨膜结构域缺失。利用生物信息学方法,我们还对珍珠鸟和家鸡PTH3R蛋白序列进行三维建模。 采用RT-PCR方法,本研究也对珍珠鸟PTH3R基因进行组织表达分析。结果显示,zPTH3R及其剪切变体zPTH3R-v1在珍珠鸟脑及外周组织中广泛表达。珍珠鸟和家鸡PTH3R基因的成功克隆与结构解析,将为下一步开展PTH3R在鸟类中的功能研究奠定重要基础。     

粘质沙雷氏菌低温脂肪酶的基因克隆与酶学性质分析

克隆一个源于北极冻土沙雷氏菌的脂肪酶基因lip18,实现其在大肠杆菌中的表达,并进行酶学性质研究.克隆脂肪酶基因lip18,并构建p ET-28a(+)-lip18重组表达载体,导入大肠杆菌BL21(DE3)中,诱导优化重组蛋白表达,并研究其酶学性质.克隆得到脂肪酶基因lip18,全长为1 842 bp,编码614个氨基酸.重组菌的诱导温度对蛋白表达影响很大,在最适诱导温度为20℃时脂肪酶大量表达,重组脂肪酶的相对分子质量约为65 ku.酶学性质研究表明:重组酶高效水解C10~C16的中、长链脂肪酸,最适作用温度30℃,最适作用pH值7.0,并且在0℃条件下有一定的催化活性,热稳定性差,是低温中性脂肪酶;同时,对有机溶剂有较好的耐受性.