重组人干扰素α2a和胸腺肽α1融合蛋白的分子设计及其基因表达产物的鉴定

人干扰素α_2a（IFNα_2a）和胸腺肽α₁（THYα₁）联合使用效果远大于各自单独使用的效果，本文通过DNA重组技术将两者构建成一个融合蛋白药物。首先，依据IFNα_2a和THYα₁的分子结构，设计了一个连接肽，将IFNα_2a和THYα₁相连，并分别位于该融合蛋白的N端和C端。在此基础上，构建出表达载体pCJ101质粒，获得的阳性克隆307在2×YT培养基小试中，产物变性复性后经DEAE-Sepharose柱层析纯化后，在SDS-PAGE上得到相对分子质量为23000的谱带。经鉴定，融合蛋白中干扰素α_2a的比酶活性为1.34mol/s·g；检测胸腺肽α₁的活性，显示活性E玫瑰花结形成率达到20%。结果表明，融合蛋白中两种药物蛋白均较好地保持各自的生物功能，为继续研究奠定了良好基础。     

吲哚美辛聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的制备

以生物降解型聚氰基丙烯酸正丁酯为载体材料,采用乳化聚合法制备吲哚美辛纳米粒,通过单因素试验初选、U₅(5³)均匀设计优选制备工艺,用透射显微镜、激光粒度分析仪、紫外分光光度法、X-射线衍射的手段对其特性进行了表征。结果表明,在pH1.5,Dextran-70与Pluronic F-68质量比为4∶1,氰基丙烯酸正丁酯体积分数为0.7%,搅拌速度为800r/min条件下制备的吲哚美辛纳米粒各项指标较为满意。特性研究表明：优化条件下制备的纳米粒球形圆整、无粘连、平均粒径为（127±3）nm,分布均匀,包封率为82.97%,载药量为64mg/g,且吲哚美辛在纳米粒中的无定形程度增加。     

重组人DNaseⅠ不同表达模式的下游工艺研究

研究了诱导温度对重组人DNaseⅠ(rhDNaseⅠ)在大肠杆菌中可溶表达的影响,发现加诱导剂后在37℃培养时,rhDNaseⅠ融合蛋白以包涵体形式存在;而20℃培养,rhDNaseⅠ融合蛋白有62.3%分泌到周质,并且具有酶活性。对这两种不同表达模式表达的rhDNaseⅠ融合蛋白进行分离纯化,发现前者最终酶活为592.2 U/mg,回收率为32.1%;后者酶活为1283U/mg,回收率为24.1%。比较这两种纯化工艺,分泌表达模式的分离纯化工艺较好。     

壳聚糖修饰的Lysozyme-PLGA阳离子纳米药物的制备与表征

通过二环己基碳二亚胺将聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)活化,又与溶菌酶进行化学键合,再采用单乳化-溶剂挥发技术制备表面带正电荷的壳聚糖(CHS)PLGA纳米微球。对纳米微球制备条件进行了优化。结果表明在ρ(CHS)=3 mg/mL,ρ(PLGA)=5 mg/mL,溶菌酶与PLGA的质量比为0.2的条件下,得到的纳米微球包封率为87.8%,载药量为14.7%。微球粒径φ可控制在(450±50)nm之间,在pH=4时,纳米微球表面ζ电位为42.5mV。SEM图像显示经CHS修饰的Lysozyme-PLGA的纳米微球形状规整。药物释放试验显示纳米微球在20 d后释放达到70%,且释放曲线规整。     

人胰激肽原酶在毕赤酵母中的分泌表达

人胰激肽原酶(hPK)编码基因由本实验室设计、合成,并重组构建成表达质粒pPIC9k-hPK。经电穿孔将该质粒转化毕赤酵母GS115 (His^-Mut⁺) ,筛选His⁺Mut^s 型高拷贝菌株,摇瓶诱导表达重组hPK。经SDS-PAGE凝胶电泳分析确定表达重组蛋白相对分子质量为37500,产量达40mg/L,质量分数占总蛋白的30%以上。初步浓缩的重组hPK经测定具有酶活性,表明其在毕赤酵母中得到了正确的表达,每mL酶活达0.717nmol/s。     

响应面法优化虎杖中反式白藜芦醇的提取工艺及抑菌活性

采用响应面分析法优化了虎杖中反式白藜芦醇的提取工艺,其最优提取工艺条件为:以体积分数79%乙醇为溶剂,53℃回流提取1.1h;此条件下白藜芦醇提取量为5.912mg/g,与理论值5.918mg/g接近。产物经红外和质谱鉴定为反式白藜芦醇(纯度99.8%)。考察了经分离纯化后的反式白藜芦醇对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的体外抑菌作用,结果表明所得反式白藜芦醇具有抑菌活性,10h后质量浓度为0.125mg/mL的反式白藜芦醇对金黄色葡萄球菌的抑菌率为80%,而质量浓度为1.00mg/mL的反式白藜芦醇对大肠杆菌的抑菌率为40%。     

毕赤酵母FLD1启动子元件的克隆与测序

为了应用毕赤酵母表达某些食用蛋白或同时表达多个异源蛋白,本文以毕赤酵母GS115基因组DNA为模板,采用prime5.9程序设计了一对不等长引物,经多轮直接多聚酶链式反应,扩增获得了大小为597bp目标DNA片段;再经限制性内切酶和双脱氧末端终止法分析,其DNA片段排列顺序与EMBL发表的FLD1启动子的序列完全一致。     

重组阳离子抗菌肽体外抗菌生物活性的初步研究

天然抗菌肽是生物体自身产生的拮抗物质。本实验利用实验室构建的基因工程菌Chjch1诱导表达了阳离子抗菌肽。表达蛋白经Tricine-SDS PAGE凝胶电泳分析确定了重组蛋白单体分子质量的正确性。经凝胶成像系统分析确定表达量为29.67mg/L。摇瓶发酵菌体最大生物量达20.8g/L。活性实验表明，重组蛋白发酵上清液对微黄色八叠球菌和大肠杆菌具有毒杀力，30μL，96h的发酵上清液对微黄色八叠球菌抑菌直径2.6cm，对大肠杆菌抑菌直径为2.36cm。     

重组人血清白蛋白在毕赤酵母表达中的降解控制

在利用转基因毕赤酵母发酵表达重组人血清白蛋白时,遇到了较为严重的蛋白降解;为了抑制蛋白的降解,分别研究了温度、pH值和氮源的加入对降解的影响。结果表明,pH值和氮源的加入对白蛋白的降解控制有显著的正面影响,而温度的变化对降解的影响不大。当控制pH为7.0,添加酵母提取物和蛋白胨体积分数分别为0.5%和1%时,白蛋白的降解得到了有效的控制,可得到质量分数为58%的完整白蛋白。     

利用毕赤酵母表达植物甜蛋白（brazzein）的初步研究

实验将含有Brazzein基因的pPIC9K穿梭质粒通过电导入巴斯德比赤酵母（Pichia pastori）GS115中，并从22个阳性克隆中筛选出His^＋Mut^s高拷贝转化子2个，经诱导表达，产物进行Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定，目标蛋白的相对分子量与理论值一致，又经小试（5～10L罐）蛋白产量可达385mg/L。利用大孔树脂D152初步分离，得到有微甜味的产物。进一步纯化后获得了¹D-NMR图谱。