大豆微粒体油酸盐脱饱和酶FAD2基因的克隆及其植物表达载体的构建

从大豆种子中提取RNA,通过逆转录PCR的方法扩增出1307bp的大豆微粒体油酸盐脱饱和酶FAD2基因,并将其克隆到pMD18-T vector,DNA测序分析表明克隆的片段与原序列相似性达到99.9%,蛋白质相似性达到100%,显示其与同科植物花生同源性最高,与其它植物FAD2的氨基酸序列同源性较低.实验室前期从锦橙中克隆了种子球蛋白基因启动子ssp,转化烟草证明具有种子特异性调控表达的特性.本研究利用ssp启动子和大豆的FAD2基因构建了在种子专一性启动子驱动下的植物表达载体p3300-ssp-FAD2-Tons,为进一步进行油料作物的脂肪酸基因工程奠定了基础.     

根癌土壤农杆菌Ti质粒毒蛋白基因VirD1的克隆及原核表达

根癌土壤农杆菌Ti质粒毒性区VirD1蛋白表现拓扑异构酶活性,能解除T-DNA边界处25bp重复序列的超螺旋状态,使外源基因的插入成为可能.本实验以C58菌株为模板,设计了一对含有BamHI和XhoI酶切位点的引物,成功克隆了VirD1基因,并构建了原核表达载体pET30a-VirD1,将其在宿主菌BL21中获得了表达,为将来构建含有VirD1基因的植物表达载体并协助目的基因转化奠定基础.     

绿豆防御素基因的克隆、序列分析和植物表达载体的构建

从绿豆叶片提取总DNA中,通过PCR方法扩增出362bp的具有多种抗病、抗虫特性的绿豆防御素基因, 并将其克隆到pGM-T easy vector,酶切图谱及DNA 测序分析表明克隆的片段包含了完整的绿豆防御素基因的编码序列,与原序列同源性达到99.5%,蛋白质同源性达到100%.此基因编码的多肽由73个氨基酸组成,含有28个氨基酸的信号肽和8个半胱氨酸,可形成4个二硫键.我们用此基因构建了高效植物表达载体pBin438-LD.     

大肠杆菌过氧化氢酶katE基因的克隆及烟草的遗传转化

过氧化氢酶是生物体内主要的抗氧化酶之一,其主要功能是催化细胞内过氧化氢的分解,清除光呼吸、线粒体电子传递以及脂肪酸β-氧化等过程中产生的H2O2,从而使细胞免于遭受过氧化氢的毒害。本实验克隆了大肠杆菌过氧化氢酶katE基因及定位叶绿体的转运肽STP,并构建了植物融合表达载体pBI．STP．katE,重组质粒通过冻融法转入根癌农杆菌GV3101。采用叶盘浸染法转化烟草,获得了部分转基因植株,为进一步研究过氧化氢酶katE基因的功能打下基础。     

天山雪莲PsbO基因的克隆、原核表达及其烟草中的遗传转化

从已建立的天山雪莲抗寒cDNA文库中筛选克隆了雪莲的PsbO基因,发现该基因全长1145bp,编码329个氨基酸。通过构建原核表达载体在大肠杆菌中成功获得表达,同时构建了植物表达载体,转化烟草,并获得了部分转基因植株。     

含有MAR序列的植物表达载体pBI121-MARs的构建

将MAR（Matrix Attachment Region）构建到外源基因表达框的两侧．可以促进外源基因的表达．减少转基因沉默。实验利用PCR方法从普通烟草基因组中分离到一段MAR序列，将其正向重复插入到植物表达载体pBI121肛葡糖醛酸酶（β-glucuronidase，GUS）基因表达框的两侧，形成一个新的植物表达载体。     

HARDY转录因子原核表达的研究

HARDY（HRD）是AP2／ERF—like家族转录因子,它的过量表达可以增强水稻的抗旱性、提高水稻的水分利用率。本研究从拟南芥中克隆了HRD转录因子基因,利用DNA重组技术,构建了HRD原核表达载体PET．HRD,并将PET－HRD重组质粒转化E．coli BL21（DE3）,经1mmol／LIPTG诱导其蛋白质表达,获得了高表达量的分子量约为42kD的HRD融合蛋白。本研究结果为进一步制备HRD转录因子的抗体,并利用该抗体来分析和克隆不同物种的HRD基因奠定了基础。     

旱麦草LEA3基因的克隆与序列分析

为了克隆旱麦草LEA3基因,根据小麦的LEA3基因(GenBank登录号为AY148492)cDNA序列设计引物,以干旱胁迫处理的旱麦草幼苗的cDNA为模板,采用RT-PCR克隆了旱麦草LEA3基因,命名为EtLEA3(GenBank登录号为KJ123698),并对基因及其蛋白进行了生物信息学分析。结果表明:EtLEA3基因的ORF全长为600 bp,编码199个氨基酸,推测的蛋白相对分子量为20.38 ku,理论等电点为9.08。其氨基酸序列与小麦、大麦和山羊草LEA3蛋白的相似性分别为83%、82%和81%。信息学分析表明EtLEA3蛋白具有较高的亲水性,没有跨膜结构。蛋白质二级结构和三级结构预测表明α-螺旋结构占主导,与目前已知的多种植物的LEA3蛋白具有相似的结构功能域。该蛋白含有5个完整的11个氨基酸组成的串联重复单元。这些特征均与第3组LEA蛋白的特征相符合。该研究结果为深入了解该基因的功能和旱麦草抗旱的分子机理提供了基础数据。