重组毕赤酵母表达猪胰岛素前体代谢参数分析和动力学模型

采用发酵过程参数相关分析理论,分析了毕赤酵母在不同发酵阶段利用不同碳源时的生理代谢参数变化特征。同时,研究了不同比生长速率下重组毕赤酵母表达猪胰岛素前体补料分批发酵过程,建立蛋白表达阶段的细胞生长非结构模型,结果表明:比生长速率和甲醇浓度符合Monod方程,最大比生长速率(μmax)为0.101h-1,基质的半饱和常数(Ks)为0.252g/L,细胞得率系数YX/S=0.386g/g,细胞维持系数m=0.011g/(g·h)。当比生长速率为0.016h-1时猪胰岛素前体(PIP)最大比形成速率(qp,max)达0.098mg/(g·h)。该模型能较好预测毕赤酵母表达阶段细胞生长和PIP表达的发酵趋势,用其控制发酵过程,目标蛋白PIP产量为优化前的1.5倍,达0.976g/L。     

人α2a干扰素酵母工程菌高产培养条件的研究

研究了摇瓶培养条件对人α2a干扰素酵母工程菌生长及表达的影响,结果表明,当基础料中腺嘌呤含量为20μg/mL,在发酵进行至12h时再加入20μg/mL腺嘌呤时,IFN-α2a生物活性及比活分别达到了7.3×106IU/mL及6.77×107IU/mg.发酵过程中后期补入适量葡萄糖,且维持低糖水平,有利表达.维持总碳源含量不变,使培养基中葡萄糖与蔗糖比例为1∶0.1,结果IFN-α2a生物活性及比活分别比对照增加了一倍以上.在发酵进行至12h时,加入2g/L谷氨酸,IFN-α2a生物活性及比活分别比对照提高了1.76倍及1.94倍,而添加0.25～1.0g/L赖氨酸也能显著提高表达水平.培养基初始pH对产物表达有较大影响,初始pH为6.5时,对表达最有利.利用上述摇瓶培养优化条件,在2.6L生物反应器中进行补料分批培养,人α2a干扰素生物活性达到了1.3×107IU/mL,为原工艺的3倍.     

人工神经网络在红霉素发酵过程状态预估中的应用

探索了动态ＢＰ网络和ＲＢＦ网络在红霉素发酵过程状态预估中的应用,比较了它们的收敛速度和学习能力。结果表明,ＢＰ网络和ＲＢＦ网络都具有相当好的学习能力,但ＲＢＦ网络的收敛速度更快,训练好的神经网络,在红霉素发酵过程中可在线预估出红霉素效价、葡萄糖浓度、ＮＨ２－Ｎ浓度、丙醇浓度和菌体浓度等参数值,并可在进上步的过程优化和控制中应用。     

生物过程尾气质谱仪在乳酸发酵工艺控制中的应用

将生物过程尾气分析质谱仪及相应的Biostar处理软件成功应用于乳酸发酵过程中,通过实时监测发酵过程中不同阶段和不同发酵条件下菌体生理代谢参数的动态变化,并对其进行多参数相关分析,阐明了发酵过程中杂质组成的合成代谢过程;利用尾气分析质谱仪进行微耗氧发酵过程供氧水平的精确控制,当菌体的摄氧率控制在0.70mmol/(L.h)时,凝结芽孢杆菌乳酸的最佳合成速率能达到2.78g/(L.h);同时在以玉米淀粉水解糖液为基质的乳酸发酵过程中,通过对菌体生理代谢参数变化与残糖的消耗和副产物生成过程进行相关分析,建立了根据生理参数的变化进行发酵过程终点快速判定方法,实现了L-乳酸发酵产量和质量的在线控制策略。     

枯草芽胞杆菌肌苷发酵过程参数相关分析

基于参数相关的研究方法已成功地应用于多个发酵产品的过程优化,本文通过对枯草芽胞杆菌肌苷生产过程的尾气变化规律、碳氮源消耗和产物浓度的分析和计算,并根据摄氧率(OUR)、二氧化碳释放率(CER)、呼吸熵(RQ)和产物得率(YP/G)的相关性,在工程尺度将发酵过程分为4个阶段,为其他尺度的研究和过程优化提供了线索。     

流式细胞仪检测重组毕赤酵母发酵过程中的细胞活性

建立了流式细胞仪检测重组巴斯德毕赤酵母(P.p astoris)细胞活性的方法,并在高密度发酵过程中得到应用。使用碘化丙锭染色法测定细胞活性,发现甲醇诱导时酵母细胞活性开始下降,随着细胞密度的增加,由于细胞胁迫和甲醇的影响,细胞活性明显下降,活细胞率最大下降了14%。与此同时,细胞生长减缓,目的蛋白发生降解,表明细胞活性与发酵过程中细胞的生长和目的蛋白生成等参数密切相关。实验证明:流式细胞仪可作为检测毕赤酵母发酵过程中细胞活性参数的一个便捷精确的有力工具。     

温度诱导模式对重组大肠杆菌质粒拷贝数的影响

对于大肠杆菌温度表达系统,温度的选择和变化对外源基因的表达至关重要,最直接的因素表现在对质粒拷贝数的影响上。本文通过重组大肠杆菌DH 5α表达载脂蛋白A I-M ilano来分析不同温度诱导模式对质粒拷贝数的影响,确立了二次升温诱导(30°C→42°C→37°C→42°C)有利于菌体质粒拷贝数的增加,从而提高目的蛋白的表达量,结果表明:二次升温诱导比一次升温诱导蛋白表达量增加80%。     

添加异戊酸对必特螺旋霉素生物合成的影响

为了进一步提高多组分必特螺旋霉素中异戊酰螺旋霉素Ⅲ和总异戊酰螺旋霉素的含量,本文通过外源添加浓度为0.5 g/L的异戊酸使异戊酰螺旋霉素Ⅲ和总异戊酰螺旋霉素的含量分别比对照提高了38.32%和31%。通过测定必特螺旋霉素发酵过程中糖耗、有机酸、亮氨酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、己糖激酶等中间代谢产物的相关数据,探讨了异戊酸调控必特螺旋霉素组分和效价的机理。     

蚯蚓纤溶酶(EFE-3D)基因的合成及其在毕赤酵母中的表达

选择毕赤酵母偏爱密码子,分成32个长约48 bp且相互配对的寡核苷酸片段,合成蚯蚓纤溶酶基因EFE-3D。寡核苷酸片段经5′磷酸化后,通过错位拼接,PCR(聚合酶链式反应)一次性完成新基因的合成并且克隆至载体pP IC 9K中。最后利用电穿孔法将新基因克隆至毕赤酵母表达系统并进行诱导表达,用免疫印记法检测表达产物,最后利用纤维平板确定其表达产物的活性为3 500 mm2/mL,1 L发酵液相当于48 m g天然蚯蚓纤溶酶活性。     

甲醇浓度和VHb蛋白表达对重组毕赤酵母生产SAM的影响

以插入AOX1启动子调控S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶/VHb表达单元的重组毕赤酵母为对象,研究了甲醇浓度及vgb表达对茵体生长、SAM产量及SAM合成酶活力的影响,同时也考察了vgb表达对胞内ATP含量及细胞活性的影响.结果表明:甲醇浓度(?(CH3OH))由0.008提高至0.016后,可提高菌体浓度、SAM产量及单位菌体SAM含量;当?(CH3OH)=0.024时,SAM产量及单位菌体SAM含量与?(CH3OH)=0.016时相当,而菌体浓度稍低于?(CH3OH)=0.016时,高于?(CH3OH)=0.008时的菌体浓度.提高甲醇浓度导致SAM合成酶活力降低,细胞死亡率增加,说明在所考察的重组菌中SAM合成酶的活性并不是SAM合成的限制因素.在上述3种甲醇浓度时,透明颤菌血红蛋白VHb表达都改善了细胞活性,并在较高甲醇浓度(0.016和0.024)时提高了胞内ATP含量.