关于(A6,A11)-双位点突变胰岛素原作为外源肽呈递骨架可行性的研究

通过重组DNA技术,以(A6,A11)-双突变胰岛素原分子为支架构建了含有外源抗栓肽功能区的嵌合分子,并在大肠杆菌进行了表达和纯化.对嵌合分子进行胰岛素受体结合活性、放射免疫活性及抗血小板聚集活性分析,结果表明该嵌合分子具有较强的血小板聚集抑制活性,而无胰岛素生物活性,证明以(A6,A11)-双突变胰岛素原作为外源肽序列呈递骨架是可行的.     

大分子拥挤试剂对人肌肌酸激酶折叠途径的影响作用研究

为研究大分子拥挤试剂对蛋白质折叠过程的影响作用及其机制提供有价值的依据,在大分子拥挤环境下进行了人肌肌酸激酶的折叠动力学研究,发现质量浓度高的大分子拥挤试剂(ρ=200 g·L-1的BSA、 Dextran 70与Ficoll 70)通过增进部分折叠中间体的错误聚集,使酶的复性产率显著降低.相对质量浓度较低的大分子拥挤试剂(ρ≤100 g·L-1)对酶的复性产率影响不大,但对酶复性的动力学过程有较大影响,一方面可使无活性单体的二聚化变为复性速率最慢的限速步骤,另一方面又加快了二聚化的折叠中间体到天然构象的复性过程.     

(A11,A12)胰岛素原移位突变体的表征研究

将(CysA11Ser,SerA12Cys)人胰岛素原移位突变体基因克隆至高效表达质粒pET22b多克隆位点区,构建重组表达质粒pET-A112,并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)pLys中进行了表达.表达产物存在于包涵体中,通过包涵体的分离及二硫键变复性,获得A6-A12二硫键突变型的胰岛素原突变体.SDS-PAGE电泳显示突变型胰岛素原的电泳迁移率与野生型胰岛素原基本相同.质谱检测表明,突变性胰岛素原的分子结构均一、纯度良好,氨基酸组成与理论值基本一致.以野生型人胰岛素原为对照进行的胰岛素受体试验及胰岛素放射免疫试验表明,A6-A12二硫键错接型胰岛素原突变体的受体结合活性和放免活性是野生型胰岛素原的11%与55%.     

使用无细胞翻译体系合成尿激酶原突变体蛋白

应用无细胞翻译体系对KGD-尿激酶原重组蛋白质进行表达,表达产物以可溶状态存在,约占体系总蛋白质量分数的5%.使用亲和层析技术对表达产物进行纯化,纯化产物具有较好的分子均一性,并表现出明显的纤溶活性.