用扩散小室对活体和离体系统中环磷酰胺(CPP)诱发CHO细胞抗白喉毒素突变型的研究

最近,我们建立了两个实验系统用来检测潜在的致突变剂或致癌剂。第一个系统是改良的宿主培养法;第二个系统是离体激活法。本文将报道环磷酰胺(cyclophosphamide,CPP)在这两个系统中诱发一个新的遗传标记——抗白喉毒素突变型(diphtheria toxin resistant     

反转录病毒介导的人凝血因子IX小基因在奶山羊乳腺中的分泌表达

通过受精卵显微注射胚胎移植建立哺乳动物乳腺生产系统是近年来生物工程领域的研究热点,但该工作周期长、成本高、难度和工作量都很大.1994年Johanna等人曾经报道以反转录病毒作载体将hGH(human growth hormone)cDNA导入山羊乳腺组织并获得表达.但是由于病毒LTR控制下的hGH基因的表达在活体动物乳腺组织内受到一定程度的抑制,因此表达水平比较低,持续时间短.我们以微小MCK(Muscle creatine kinase)增强子,β-actin启动子控制hFⅨ(human clotting factorⅨ)小基因(minigene)表达顺序反向插入GINa框架,构建为复制缺陷反转录病毒载体.首次通过反转录病毒直接转染活体奶山羊乳腺小叶和乳腺导管导入的方法建立了hFⅨ蛋白的乳腺表达系统.hFⅨ蛋白在羊奶中的最高表达量为47.9ng/mL乳汁,其中1头奶山羊2个月后表达量仍维持在12ng/mL乳汁.Western blot和活性检     

一种新型的低辅毒污染的重组AAV生产系统

将Cre-loxP系统引入重组AAV的生产过程之中, 用缺陷型腺病毒AdLC作为生产重组AAV的辅助病毒. 在大量生产带有目的基因(EGFP, hFⅨ )的重组腺相关病毒载体的同时, 最大程度地限制了辅助病毒的产生, 从而减轻了下游纯化工作的压力. 活体动物实验的结果证实了这种方法的优越性. 实验结果为重组AAV载体系统在基因治疗领域中的应用提供了一条新的途径.     

利用精原干细胞建立人凝血因子Ⅸ转基因小鼠

用玻璃针将Effectene^TM包裹的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)表达载体注入小鼠的曲精细管. 通过PCR和Southern印迹法对子代41只小鼠进行鉴定, 有2只小鼠的基因组中整合有hFⅨ基因表达框架, 整合率为4%(2/41). 通过ELISA方法在其中1只小鼠的血浆中检测到hFⅨ的表达, 表达量为4.6 ng/mL. 实验证明, 精原干细胞法是建立转基因动物的有效途径, 为乳腺反应器的研究提供了另一个技术手段. 同时也为通过生殖细胞途径治疗血友病B提供了新的选择.     

中国血友病B生物基因治疗研究状况

血友病B为一种严格的X连锁隐性遗传病, 由于其单纯的分子遗传基础和明确的临床表现, 容易观察疾病治疗的效果; hFⅨ较小的基因规模可以适用于几乎所有的常用基因载体系统. 在多种细胞均可以获得有效的表达使得基因治疗时可以有广泛的细胞选择范围, 同时也为生物工程制备重组蛋白药物提供了便利. 而且, 血友病B有天然和基因操作形成的动物模型便于治疗的临床前实验研究. 基于上述理由, 血友病B一直是遗传病基因生物治疗和重组蛋白药物制备的重要模型. 我国在20世纪90年代成功完成了基因治疗血友病B的临床试验, 对推进我国的基因治疗起到重要作用. 本文简述我国在血友病B的生物基因治疗方面的研究情况与发展方向, 希望为基因治疗和重组蛋白药物研究人员提供参考.     

不同重组慢病毒介导人凝血因子Ⅸ cDNA在血友病B小鼠中表达的影响

血友病B是凝血因子Ⅸ(hFⅨ)缺乏所导致的严重凝血功能障碍、X-连锁隐性遗传性疾病,在男性中的发病率为三万分之一．目前没有理想的治疗措施,而基因治疗可能是根治该病的安全、有效方法．该实验构建了ubiquitin—c和ABP(肝特异性)启动子指导hFⅨ表达的载体FUXW、FAXW,利用磷酸钙法共转染三质粒制备高滴度的重组慢病毒．将不同剂量的重组FUXW、FAXW病毒,分别用尾静脉液压法和静脉缓注法注射入血友病B小鼠体内,各治疗组小鼠血浆均可持续检测到hFⅨ抗原,最高峰值为45ng／mL,表达持续超过60d．结果表明：hFⅨ蛋白的表达与病毒的剂量成正相关,重组FAXW病毒的hFⅨ表达量高于重组FUXW病毒,而尾静脉液压组和静脉缓注组在表达量、表达时间上没有显著差异．     

人凝血Ⅸ因子乳腺特异性表达载体在离体细胞和小鼠乳腺组织中表达的初步研究

以小鼠MAR（matrixattachmentregion）元件,牛β－酪蛋白（β－casein）基因5＇端2．0kb调控顺序,人凝血Ⅸ因子小基因（hFIXminigene）构建乳腺组织特异性表达载体,表达载体和质粒pSV－neo共转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO）,兔皮肤纤维细胞（RSF）和人胚肾上皮细胞（293细胞）．发现hFIX基因在CHO细胞中获得低水平表达,最高表达量为7．2ng／ml．在皮肤成纤维细胞中的表达量低于2ng／ml．在293细胞中没有表达．表达载体用stearylamine（SA）脂质体包埋后尾静脉注射哺乳期小鼠,hFIX蛋白在小鼠乳汁中表达水平高达87．34ng／ml．     

D-box附近泛素化位点突变对Cdc20介导的Sp100蛋白降解的影响

前期的研究发现Cdc20介导Sp100通过泛素-蛋白酶体途径降解,Sp100中的D-box在底物识别过程中具有重要作用.尽管在PML和DAXX中都存在典型的D-box序列,但是这两种蛋白都不能被Cdc20所识别.本研究中,我们构建了一系列含D-box的Sp100截断体来探讨Cdc20底物识别的必要序列.研究发现GFP-Sp100(152-182)截断体包含D-box但是不能被APC/C-Cdc20降解.GFP-Sp100(151K→G)突变潜在泛素结合位点后,Sp100降解显著受到抑制.远离D-box的潜在泛素化位点(217K,219K,225K)破坏后对Sp100降解没有影响.我们的结果表明,Sp100蛋白中D-box附近泛素化位点(151K)在Cdc20介导的蛋白降解中是必要的.     

携带人凝血因子Ⅸ突变衍生物基因重组腺相关病毒的大量制备与体内外表达研究

构建了一系列携带有人凝血因子Ⅸ突变衍生物基因（ｈⅨＲ３３８Ａ）及不同调控元件的腺相关病毒 表达载体,并经体外转导不同的细胞系,筛选、优化,挑取高表达质粒及其转导稳定细胞克隆,然后, 以一个携带有腺相关病毒包装蛋白的ｒＡＡＶ/ＨＳＶ杂合病毒包装系统介导进行重组腺相关病毒的大量制 备,建立了可进行产业化制备的技术路线及高滴度、大量制备重组腺相关病毒的技术方法,所获得的重 组病毒滴度达 １．２５ × １０１２病毒颗粒／ｍＬ,然后,利用这一重组病毒,对ｒｈＦⅨＲ３３８Ａ进行离体及在体表达, 获得了 ｒｈＦⅨＲ３３８Ａ在肌细胞系 Ｃ２Ｃ１２及血友病 Ｂ小鼠体内的高效表达,表达峰值分别达（２５５１．３２± ９２．１４）ｎｇ·（１０６细胞）－１·（２４ｈ）－１及４６３．２８ｎｇ·ｍＬ－１,与野生型Ⅸ因子的表达水平（２５６５．７６±６４．３６）ｎｇ· （１０６细胞）－１·（２４ ｈ）－１及４５３．９２ ｎｇ· ｍＬ－１无显著性差异．然而,其凝血活性却成倍增加,约为后者的 ２．４６倍.．将人凝血因子Ⅸ突变衍生物基因引入血友病 Ｂ基因治疗研究之中,同时,探讨了一个新的包装 系统──ｒＡＡＶ／ＨＳＶ杂合病毒包装系统──在重组ＡＡＶ载体大量制备中的应用     

采用重组小鼠凝血因子Ⅸ制备单克隆抗体的研究

将小鼠凝血因子Ⅸ (mFⅨ )cDNA蛋白编码区序列克隆至原核表达载体 pQE30 ,在大肠杆菌M 15中获得高效表达 (约占细菌蛋白总量的 5 1 2 % ) ,并经过SDS PAGE纯化获得均一的重组mFⅨ蛋白 .以此蛋白为抗原 ,免疫Lou/MN系大鼠 ,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞 (Sp 2 / 0 )融合后 ,经 3次克隆化选择获 2株杂交瘤细胞(H4B5和C2B10 ) .以 1× 10 6杂交瘤细胞注射免疫缺陷型裸鼠 ,10d后获得腹水 .对此单抗的功能和特异性初步研究表明 ,所制备的抗小鼠FⅨ单抗可用于Western免疫印迹等研究 .