表达钙调素反义RNA人肝癌细胞模型的建立及其对细胞增殖和转化的作用

作为Ca~(2+)在细胞内的主要受体,钙调素(Calmodulin,CaM)广泛存在于各种真核细胞中,是一种能调节细胞生长、分化和转化的多功能蛋白。 由于CaM的反义RNA相对于它的多种拮抗剂来说具有更强的特异性并且没有药理毒性作用,因此我们构建了表达钙调素反义RNA的人肝癌细胞模型,并对此模型在钙调素低表达状态下的生长特性、周期分布、基因表达及其与转化的关系进行了分析,以探讨钙调素对细胞增殖与转化的影响。     

p14ARF高表达对γ射线诱导的人黑色素瘤细胞凋亡的影响

抑癌因子ARF可以激活p53诱导细胞周期的阻断或凋亡. 为阐明ARF在促进细胞凋亡作用中的分子机理, 建立了高表达p14^ARF的人黑色素瘤A375细胞模型. 实验表明, p14^ARF高表达能促进p53富集在细胞核. 经 γ 射线照射后，发现p14^ARF高表达能促进A375细胞凋亡, 促使Smac从线粒体释放到胞质中, p53, Bax, Caspase-3, Caspase-9, p21^cip1和p27^kip1蛋白水平明显提高, 而Bcl-2和磷酸化的ERK蛋白水平下降. 提示γ 射线辐照下, p14^ARF促进A375细胞凋亡是ERK介入的依赖p53的以线粒体为核心的凋亡途径.     

P15INK4b/MTS2对人肝癌细胞增殖的影响及其机理的初步分析

利用自行构建的稳定高表达P15INK4B 的人肝癌细胞, 研究了抑癌基因P15 在细胞增殖中的作用. 首先将抑癌基因P15 的cDNA 构建到高效真核表达的质粒载体pXJ41-neo 中的EcoR / Xho 位点, 构建成P15 真核表达质粒pXJP15. 通过脂质体法将pXJP15 质粒转染人肝癌细胞 SMMC-7721, 进一步用G-418 筛选, 获得了稳定高表达P15 的人肝癌细胞模型SHT 及相应的表达空载体的对照细胞模型SVXJ. 通过Northern, Western 分子杂交分析, 表明SHT 细胞中P15 基因表达和蛋白水平都明显高于对照组细胞, 证实成功地建立了P15 高表达的人肝癌细胞模型. 与对照组相比, P15 高表达的SHT1 细胞的增殖受到抑制, 流式细胞光度术和MI 值测定表明P15 阻抑细胞由G₁ 期向S 期和由G₂ 期向M 期的转换. Western 免疫印迹分析结果表明, 癌基因c-myc, c-fos 的蛋白水平表达下降可能是P15 抑制细胞增殖的分子机理之一.     

紫龙金对BGC-823细胞增殖的抑制作用及对p16~(INK4a)启动子活性的影响

利用记数法和Brdu脉冲标记法研究了紫龙金对细胞增殖的影响,western blot检测结果表明:紫龙金(3,4mg.mL-1)处理可明显抑制人胃癌BGC-823细胞的生长、提高BGC-823细胞中p16的表达水平.进一步利用含有p16INK4a启动子片段(-967~-165区域)及荧光素酶报告系统的载体pGL3-Basic-p16N研究了紫龙金对p16INK4a启动子活性的影响及其作用的分子机制,结果表明,紫龙金可能通过提高p16INK4a启动子活性而促进p16的表达,从而抑制细胞的增殖.     

微丝解聚对DNA合成的影响

G_0期细胞在10％血清培养液刺激后向S期行进的早期出现微丝解聚的变化.细胞松弛素B(CB)0.5mg·L~_(-1)使微丝发生部分解聚能加强血清对DNA合成的刺激作用.但随着CB剂量的加大,微丝解聚的加强,便逐步增强对DNA合成的抑制作用.发现用5,10mg·L~(-1)的CB短时间处理G_0期细胞可强烈刺激蛋白激酶C(PKC)活性,虽使微丝暂时完全解聚,但不影响向S期的过渡及DNA的合成.促癌剂TPA(12-tetradecanoyl phorbol-13-acetate)可刺激G_0期细胞PKC活性,并能促进血清对DNA合成的刺激作用,但小剂量CB和TPA促进DNA的合成均依赖于血清的存在。     

PMA对人肝癌细胞中Ha-ras基因启动子活性的影响及与PKC活性的相关性

为探讨佛波脂PMA的生物作用与癌基因ras表达及与PKC信号通路的相关性,用人肝癌细胞BEL-7402为模型,以荧光素酶为报告基因观察了PMA对Ha-ras启动子活性的影响.当用100μg/L PMA长期处理人肝癌细胞BEL-7402时,可明显抑制肿瘤细胞生长.通过RT-PCR和Western Blot分析发现,PMA处理后的BEL-7402细胞中Ha-ras mRNA和蛋白水平均明显下降.进一步观察了PMA对Ha-ras基因启动子活性的影响.通过构建含有Ha-ras启动子序列的、以荧光素酶为报告基因的pGL3-ras真核表达载体,利用脂质体瞬时转染技术将其转入BEL-7402细胞中,并通过荧光素酶活性的检测,发现PMA作用48和72h后的BEL-7402细胞中,Ha-ras启动子活性分别被抑制了55%和54%,同时PKC活性分别下降了76.7%和75.7%.并进一步观察到PKCα和βⅠ蛋白水平明显降低.实验结果表明,PMA长期处理的人肝癌细胞可通过抑制Ha-ras启动子的活性使Ha-ras基因表达被抑制,并且可能与PKC信号通路有关.     

钙调素拮抗剂诱导人肺癌细胞PLA-801凋亡机理研究

用２０μｍｏｌＬ＾－１的ＴＦＰ处理人肺癌细胞ＰＬＡ－８０１,强烈抑制了细胞的增殖。软琼脂实验发现加药组细胞集落形成率为对照组的６３．６％,这表明部分细胞失去了在软琼脂中形成集落的能力。流式细胞光度术显示,加药组细胞Ｇ１期峰前出现了程度性细胞死亡的特征峰,荧光染料Ｈｅｏｃｈｓｔ３３３４２染色后,荧光显微镜下观察,可见到部分细胞凋亡时核凝集,边化,断裂的情形。     

流式细胞光度术的初步建立——在MPVⅡ显微光度计基础上改装的流式细胞光度计

流式细胞光度术(Flow Cytometry)是六十年代末发展起来的一项新技术。它可以在细胞群体中对单个细胞逐个进行高速的定量分析和分类,从一个细胞中可同时测得蛋白质、DNA、细胞体积及核与细胞直径比例等多种参数,具有高速度多信息分析的特点,是研究细胞生物学、免疫生物学、体细胞遗传学、生物化学、肿瘤学的有力手段。目前使用的流式光度计基本上有两种类型:一种是以汞灯作光源,在落射光照明条件下,激发通过流动室的细胞悬液,测量细胞发出的荧光强度,另一种是以激光激发按重力方向流动的细     

~(57)Co(钴~(57))-争光霉素掺入人食管鳞癌细胞株CaEs—17的增殖周期时相

我国自行筛选的抗肿瘤抗菌素-争光霉素与博莱霉素的理化性质基本相同。~(57)Co-争光霉素A_2+B_2混合品和A_5纯品掺入人食管鳞癌细胞株CaEs—17的放射自显影图表明~(57)Co-争光霉素(混合品和A_5)掺入到CaEs—17细胞核中,核仁掺入很少,胞质不掺入。这和博莱霉素与DNA的特异性结合、并与DNA相互作用、而不与rRNA、tRNA、血清白蛋白结合和作用的结果是一致的。从而在细胞内定位方面说明了争光霉素与DNA结合的特异性。通过~(14)C-TdR与~(57)Co-争光霉素同时掺入及先后掺入的双标记放射自显影图和显微分光光度计对标记和未标记细胞DNA相对含量测定等方法,证实了~(57)Co-争光霉素(混合品和A_5)掺入到含有G_1/G_0DNA含量的CaEs—17细胞中。