HCV感染通过Erk信号的激活上调PTTG1的表达

 为探讨丙型肝炎病毒(HCV)感染导致肝细胞癌发生的分子机制,利用前期研究建立的体外HCV细胞培养体系,将HCV JFH-1 RNA转染CD81-Huh7细胞,确定能够获得感染性HCV后,收集HCV转染后10,50,100和150d的细胞,采用Real time PCR及Western Blot法检测不同时间点细胞内垂体瘤转化基因1(PTTG1)基因和蛋白水平的表达情况,同时检测总MAPK/Erk1/2,磷酸化Erk1/2(p-Erk1/2)蛋白的表达。随后,用干扰素抑制HCV的感染,再检测PTTG1及MAPK/Erk1/2的表达情况,以及用MAPK/Erk抑制剂(PD98059)阻断MAPK/Erk 1/2的磷酸化后,检测PTTG1的表达情况。结果显示,HCV转染的细胞与未转染细胞比较,PTTG1的mRNA和蛋白表达均显著增加,p-Erk1/2蛋白显著升高(P＜0.05);抑制HCV感染显著降低PTTG1的表达和MAPK/Erk1/2的磷酸化(P＜0.05);MAPK/Erk1/2抑制剂显著降低了PTTG1基因和蛋白的表达(P＜0.05)。体外HCV感染可以导致MAPK/Erk信号通路的磷酸化,进一步导致原癌基因PTTG1的表达增加,这可能是慢性HCV感染导致HCV相关性肝细胞癌发生的分子机制之一。     

咖啡酸四聚体异构体基于MAPK/NF-κB信号通路的体外抗炎作用机制研究

目的 探讨从新疆软紫草中提取分离得到的咖啡酸四聚体同分异构体(KC-Ⅱ)对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7巨噬细胞的体外抗炎作用研究。方法 采用MTT比色法检测细胞活力、Griess法检测细胞中NO含量、RT-PCR检测KC-Ⅱ对LPS诱导的RAW264.7细胞中促炎因子的mRNA表达影响,Western Blot检测INOS和COX-2以及Akt、MAPK/NF-κB信号通路的蛋白表达水平,细胞免疫荧光法检测了P-Erk1/2和P-P65蛋白在细胞中的分布以及荧光强度。结果 MTT结果显示,KC-Ⅱ浓度低于300μmol·L^-1时细胞增殖差异无统计学意义;RT-PCR结果显示,与模型组比较,KC-Ⅱ处理组能显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中INOS、COX2、IFN-β以及促炎因子IL-6、TNF-α和IL-1β的表达;Western Blot结果表明,KC-Ⅱ处理组明显抑制INOS、COX2的表达以及MAPK/NF-κB信号通路中Erk1/2、Jnk、P65以及IKKα/β的表达。结论 KC-Ⅱ化合物通过抑制MAPK/NF-κB信号通路的Erk1...     

RASA1通过调控Ras-MAPK通路抑制滋养细胞的增殖迁移功能

目的:探索RASA1对滋养细胞HTR-8/Svneo功能的调控作用及机制.方法:收集不明原因复发性流产(URSA)患者胚胎绒毛组织.Western blot检测绒毛组织及HTR-8/Svneo细胞中RASA1表达水平,以及Ras-MAPK通路中关键蛋白Ras活化和p38 MAPK磷酸化水平.CCK-8及划痕实验检测HT...     

乌头赤石脂丸汤方对心肌细胞氧化应激损伤的保护作用及其可能的分子机制

为了观察乌头赤石脂丸汤方含药血清对H9C2细胞氧化应激损伤的保护作用与可能的分子机制,采用过氧化氢处理H9C2细胞构建氧化应激损伤模型:以乌头赤石脂丸汤、参附汤连续灌胃SD大鼠1周,制备含药血清.将H9C2细胞随机分成空白对照组、模型组、阳性对照组、实验组、空白抑制剂组、模型抑制剂组、阳性抑制剂组、实验抑制剂组。过氧化氢造模浓度为400μmol/L,GDC-0994浓度为1μmol/L,分组给药后培养4h。用CCK-8法检测各组细胞活力,用Western blot法检测细胞中Erk1/2、p-Erk1/2、Nrf2、HO-1蛋白表达水平。实验结果显示:(1)与空白对照组比,模型组的细胞活力显著降低(P0.01),Erk1/2磷酸化的水平降低,Nrf2、HO-1蛋白的表达降低(P0.01);(2)与模型组相比,实验组、阳性对照组细胞活力显著升高(P0.01),Erk1/2磷酸化水平降低,Nrf2、HO-1蛋白的表达降低(P0.01);(3)与阳性对照组相比,实验组细胞活力显著升高(P0.01),Erk1/2磷酸化水平,Nrf2、HO-1蛋白的表达升高(P0.01);各组之间Erk1/2总蛋白表达无差异。(4)GDC-0994能够抑制乌头赤石脂丸汤方对细胞活力的保护作用(P0.01),抑制乌头赤石脂丸汤方对p-Erk1/2,Nrf2,HO-1表达的上调作用(P0.01)。研究表明乌头赤石脂丸汤方可以通过抑制氧化应激途径发挥对H9C2心肌细胞的保护作用,对抗再灌注引起的心肌细胞损伤。该作用是通过促进Erk1/2磷酸化,增强Nrf2、HO-1蛋白的表达,活化Erk1/2/Nrf2/HO-1信号通路进行的。本研究为阐明乌头赤石脂丸的心血管保护作用及治疗急性心肌梗死的作用提供了实验依据。     

雌激素对H_2O_2诱导PC12细胞氧化应激的保护作用研究

为了探讨雌激素对H2O2诱导PC12细胞氧化损伤的影响及其可能机制.用H2O2处理PC12细胞建立氧化应激模型,并加入雌激素预处理作为保护.MTT法检测细胞活力,利用荧光探针对细胞内ROS进行荧光染色检测荧光强度,Hoechst/PI荧光染色,分析细胞凋亡情况,Western blotting检测MAPK(Mitogen-Activated Protein Kinase)的磷酸化水平.结果显示:H2O2作用于PC12细胞后显著降低细胞活力,10-8～10-6mol/L的雌激素预处理后均能部分阻断H2O2对细胞活力的影响.H2O2能显著增强PC12细胞的ROS荧光强度,雌激素可明显减少H2O2处理后PC12细胞内的ROS含量.H2O2激活MAPK,而雌激素抑制了p38的磷酸化,增加了ERK的磷酸化.以上结果表明,雌激素可以拮抗H2O2诱导的氧化应激,抑制p38的磷酸化,增强ERK的磷酸化可能是其发挥保护作用的机制之一.     

Physagulin H通过阻断NF-κB和JNK/MAPKs信号通路抑制LPS诱导RAW 264.7细胞产生的炎症反应

采用脂多糖诱导的RAW 264. 7巨噬细胞体外炎症模型评价physagulin H的抗炎活性.以MTT法评价细胞毒性,Griess法检测NO的含量,ELISA法检测PGE2和TNF-α水平,Western Blot法检测炎症蛋白表达(iNOS和COX-2)以及对NF-κB炎性信号通路(IκB-α蛋白降解)和对MAPKs通路(JNK,p38和ERK蛋白磷酸化)的调控作用,研究physagulin H的抗炎活性及作用机制.结果表明,physagulin H可显著降低巨噬细胞RAW264. 7中NO、PGE_2和TNF-α的释放,还可显著降低iNOS和COX-2蛋白的高表达且呈浓度依赖性.Physagulin H对LPS诱导NF-κB/IκB-α降解具有显著抑制作用.进一步的抗炎机制研究表明,physagulin H能抑制JNK磷酸化,但对ERK 1/2和p38磷酸化无明显抑制作用.综上,physagulin H是通过调控NF-κB和JNK/MAPKs信号转导通路下调LPS诱导的炎性蛋白的高表达,进而抑制小鼠巨噬细胞产生和释放过量炎症介质以及炎症因子,从而发挥抗炎作用.     

野漆树苷对LPS诱导的RAW264.7细胞的抗炎作用及机制探究

目的:探究野漆树苷(Rhoifolin,RHO)对细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞炎症模型释放炎性因子的影响,并探讨其作用机制.方法:用脂多糖(0.5μg·mL~(-1))刺激体外生长良好的RAW264.7细胞24h建立体外细胞炎症模型,以MTT法测定不同浓度RHO对RAW264.7细胞的毒性作用,用Griess试剂法检测一氧化氮(Nitric Oxide NO)的含量,RT-PCR法检测细胞中肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor,TNF-α),白介素1β(Interleukin-1β,IL~(-1)β),白介素6(Interleukin,IL-6)的含量,采用Western Blot法检测MAPK信号通路中相关蛋白的含量.结果:与空白对照组相比,在LPS诱导下,RAW264.7细胞分泌致炎因子NO,TNF-α,IL~(-1)β,IL-6(P0.01);与模型组相比,25~100μmol·L~(-1)的RHO可明显下调LPS诱导的RAW264.7细胞释放炎症因子NO,TNF-α,IL~(-1)β和IL-6(P0.05,P0.01),并呈现良好的剂量依赖关系;野漆树苷还不同程度的抑制了Erk和JNK激酶的磷酸化.结论:RHO可以抑制LPS所致的RAW264.7细胞炎症反应,减少炎症因子NO分泌,抑制TNF-α,IL~(-1)β和IL-6mRNA的合成,抑制JNK/SAPK及Erk信号通路可能是其抗炎作用机制之一.     

阿维A对HaCaT细胞增殖的影响

目的:探讨阿维A对角质形成细胞(HaCaT)增殖的影响及其发挥作用的适宜浓度.方法:分别以浓度为1×10-7mol/L、1×10-6mol/L、5×10-6mol/L阿维A作用于HaCaT细胞,用四氮唑盐类化合物(MTS)比色法检测每组12、24、48和72 h HaCaT细胞的增殖情况.结果:与空白对照组相比,大于或等于1×10-6mol/L阿维A可以抑制HaCaT细胞增殖,并且在作用24 h后随着阿维A浓度的增加,其对HaCaT细胞增殖的抑制作用增强.结论:阿维A抑制HaCaT细胞增殖适宜浓度为5×10-6mol/L.     

牛磺酸干预对高糖培养H9c2心肌细胞的保护效应与机制

为研究与分析牛磺酸干预对高糖培养H9c2心肌细胞的保护效应及其具体机制。通过将复苏的H9c2心肌细胞传至3～4代,分为以下三组:(1)对照组(CN):葡萄糖浓度为5. 5 mmol/L;(2)高糖组(HG):葡萄糖浓度为25. 5 mmol/L;(3)牛磺酸干预组(TAU):HG组基础上,加终浓度为40 mmol/L的牛磺酸。48 h后收集细胞,采用Annexin-V/碘化丙啶(propidine iodide,PI)结合流式细胞仪检测心肌细胞凋亡发生情况,Western Blot检测丝裂原活化蛋白激酶p38 MAPK的蛋白表达,放射免疫法检测TNF-α表达量,并采用相关试剂盒检测丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平。结果显示:与CN组相比较,HG组H9c2心肌细胞经高糖培养48 h后细胞凋亡率增加(P 0. 001),细胞TNF-α、MDA显著水平升高(P 0. 001),SOD水平降低(P 0. 001),胞内磷酸化p38水平亦升高(P 0. 001);加入牛磺酸干预后,与HG组比较,TAU组细胞凋亡率减小(P 0. 01),细胞TNF-α、MDA及磷酸化p38蛋白水平明显降低(P 0. 05),SOD水平升高(P 0. 01)。可见牛磺酸能够减轻高糖刺激下H9c2心肌细胞的凋亡,其机制可能通过上调SOD水平,下调TNF-α、MDA水平,降低胞内p38磷酸化来实现对高糖细胞损伤的保护效应。     

食品中痕量Cu(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)的极谱测定

用单扫描极谱法研究了铜铁试剂(Cup)-六次甲基四胺(C6H12N4)-HAc体系的伏安行为,发现在pH为4.0~4.5,0.4 mol/L的六次甲基四胺中,铜(Ⅱ)、铅(Ⅱ)在铜铁试剂存在下,分别于-0.26 V(vs.SCE)-、0.58 V(vs.SCE)左右产生一尖锐、灵敏的二次导数极谱波.铜(Ⅱ)、铅(Ⅱ)的浓度分别在8.0×10-8~8.0×10-6mol/L、4.0×10-8~8.0×10-6mol/L的范围内与相应的峰电流成线性关系,检出限分别为1.0×10-8mol/L和6.0×10-9mol/L.该方法用于大米、大白菜中铜(Ⅱ)、铅(Ⅱ)浓度的测定,结果满意.     

模拟微重力抑制间充质干细胞增殖机制的研究

研究微重力对间充质干细胞增殖影响的潜在机制.用随机定位仪模拟微重力(SMG),培养小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),检测SMG对BMSCs增殖,细胞骨架,以及对细胞的黏附和增殖重要信号分子表达的影响.结果显示,在SMG下,BMSCs增殖受到抑制;细胞微丝结构和分布异常;细胞形态改变;黏着斑激酶(FAK)表达下降;细胞生长信号分子ERK1/2和Akt的磷酸化水平以及p85β表达下降.结果表明,模拟微重力条件下的细胞骨架改变、细胞黏附性降低和细胞增殖的信号通路相互作用,导致对骨髓间充质干细胞增殖的抑制作用.     

p38丝裂原活化蛋白激酶和核因子-κB促进创面血管化的机制探讨

目的:探讨p38丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路和核因子-κB(NF-κB)/抑制因子(IκB)通路在调控血管内皮细胞生长因子(VEGF)产生及血管化等方面的作用及其相互关系.方法:将32只Wistar大鼠完全随机分为4组各8只:假烫组、烫伤组、烫伤+p38MAPK抑制剂组和烫伤+NF-κB抑制剂组.除假烫组以外,其余各组均制作深Ⅱ°烫伤模型,其中烫伤+p38MAPK抑制剂组和烫伤+NF-κB抑制剂组于烫伤后15 min和12 h分别静脉注射SB203580和PDTC;各组大鼠均于伤后48 h处死并取材.酶联免疫吸附法(ELISA)测定创面组织中VEGF的含量和血管微密度(MVD),蛋白印迹(Western blotting)法检测p38MAPK和IκBα的表达.结果:和假烫组相比,伤后48 h,烫伤组创面组织中VEGF的质量浓度明显上升,为(0.81±0.19)ng/m L和(2.88±0.32)ng/m L,(P0.05);MVD值明显增加,为(3.12±0.72)和(8.08±2.10),(P0.05);p38 MAPK含量升高,为(966±176)和(4778±332),(P0.05);IκBα含量下降,为(2 327±310)和(1 278±149),(P0.05).使用SB203580和PDTC均能抑制烧伤后创面组织中VEGF含量的上升和血管化.预先给予SB203580能抑制烧伤后创面组织中p38MAPK含量升高,但对IκBα含量无显著影响;预先给予PDTC可以防止烧伤后创面组织中IκBα含量的下降,而对p38MAPK表达无影响.结论:在烧伤后创面愈合过程中,p38 MAPK信号转导通路和NF-κB/IκB通路是两个平行和独立的信号转导通路,两者间无直接的联系,但共同调节着烧伤后VEGF的产生与创面血管化.     

PDIA3对人Jurkat T细胞TCR信号通路的调控

为了研究蛋白质二硫键异构酶A3前体(protein disulfide isomerase A3 precursor, PDIA3)在T细胞受体(T cell receptor, TCR)信号通路中的具体功能,利用电穿孔法将T 细胞内的PDIA3蛋白水平敲低,通过Western blotting检测ζ-链相关蛋白70(zeta-chain associated protein 70, ZAP70)的磷酸化修饰水平, 酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)实验检测细胞因子IL-2的分泌情况,流式细胞术分析分化抗原簇69(cluster of differentiation 69, CD69)表达水平及荧光素酶报告基因检测NF-κB信号通路.结果显示:T细胞中PDIA3蛋白下调后导致ZAP70蛋白的磷酸化水平、CD69表达和IL-2的分泌都明显降低,并且影响了NF-κB信号通路,表明PDIA3蛋白对T细胞的活化有促进作用,参与T细胞TCR信号通路的调控,为进一步深入研究PDIA3与TCR下游一些功能蛋白的相互作用打下了基础.     

DNA拓扑异构酶Ⅱβ结合蛋白1（TopBP1）磷酸化功能位点推测及功能分析

为阐明DNA拓扑异构酶Ⅱβ结合蛋白1(TopBP1)参与DNA损伤修复应答的分子机制，本研究通过生物信息学分析，发现多个潜在的TopBP1磷酸化位点T860，S887，T1104及T1167，利用分子生物学手段从人cDNA文库中扩增并获得TopBP1克隆质粒，将上述磷酸化位点突变为丙氨酸，观察突变质粒转染细胞对DNA损伤修复的应答反应. 结果显示，在粒子射线照射或化疗药物处理细胞后，第1104丙氨酸突变（T1104A） 的TopBP1蛋白导致pRPA32-S33的磷酸化水平大幅降低，同时细胞周期检验点失活，严重阻滞了DNA应激反应，证实T1104是TopBP1参与DNA损伤修复的关键活性位点.     

冬凌草甲素抑制脂多糖诱导小鼠肺泡巨噬细胞炎症反应

目的 评价冬凌草甲素对脂多糖(LPS)诱导的小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S)的抗炎作用，并探讨其机制。方法 台盼蓝法检测不同浓度(0、0.25、0.5、1.0、2.0μg·mL^-1)冬凌草甲素对MH-S细胞的毒性影响；用荧光定量PCR和酶联免疫吸附试验分别检测不同浓度冬凌草甲素对脂多糖诱导MH-S细胞一氧化氮(NO)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧合酶-2 (COX-2)和前列腺素(PGE2)的mRNA和蛋白质水平的影响；Western blot检测不同浓度冬凌草甲素对脂多糖刺激的MH-S细胞中mitogen-activated protein kinases (MAPK)磷酸化水平的影响。结果 台盼蓝实验结果显示不同浓度的冬凌草甲素对MH-S细胞无明显毒性；荧光定量PCR和酶联免疫吸附试验结果显示冬凌草甲素可以剂量依赖性地抑制脂多糖诱导的MH-S细胞中NO、iNOS、COX-2和PGE2 mRNA和蛋白质的表达；Western blot结果显示冬凌草甲素剂量依赖性地抑制p38、ERK1/2和JNK的磷酸化。结论 冬凌草甲素能有效抑制脂多糖诱导的MH-S细胞炎症...     

CH(X2Ⅱ)与NH3反应机理的量子化学研究

对CH(X2Ⅱ)自由基与NH3的反应进行了量子化学研究.分别在B3LYP/6-311++G(d,p),B3LYP/6-311++G(3df,3pd),MP2/6-311++G(d,p)和MP2/6-311++G(3df,3pd)水平优化了反应势能面上各驻点的几何结构,并在QCISD(T)/6-311++G(3df,3pd)水平上计算了各驻点的能量.通过IRC计算确认了过渡态,确定了反应的机理.     

油橄榄叶提取物对非酒精性脂肪肝小鼠TLR4?p38 MAPK信号通路的干预作用

探讨油橄榄叶提取物干预非酒精性脂肪肝(NAFLD)的作用机制。用高脂饮食9周建立小鼠NAFLD模型,造模第2周起用OLE(1 000 mg/kg)进行灌胃治疗8周,利用全自动生化分析仪测定血脂水平,放射免疫法检测炎症因子指标,定量PCR和酶联免疫吸附法(ELISA)检测肝组织中Toll样受体蛋白4(TLR4)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)的水平和蛋白活力。结果显示,与模型组比较,OLE干预后,血清甘油三酯(TG)、游离脂肪酸(FFA)浓度显著降低;肝脏肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1(IL-1β)、TLR4、p38MAPK水平和蛋白显著降低。OLE可通过调节TLR4-p38MAPK信号通路,缓解肝脏脂肪变性和炎症因子反应,抑制NAFLD的进展。     

CD11b调控LPS刺激下巨噬细胞表达IL-12的分子机制

CD11b是白细胞整合素家族成员之一,在炎症的发生和发展中发挥重要作用.在内毒素血症小鼠模型,发现脂多糖(LPS)导致外周血白细胞介素12(IL-12)水平降低,而CD11b抑制剂能防止此现象发生.为阐明CD11b调控LPS刺激下IL-12产生的分子机制,本文利用RAW264.7细胞开展了进一步研究.酶联免疫吸附、实时定量PCR和Western Blot等检测结果表明,CD11b可抑制LPS刺激下RAW264.7细胞IL-12的表达;利用sh RNA敲低CD11b的表达则能提高LPS刺激下RAW264.7细胞IL-12p35、IL-12p40的转录水平和蛋白水平的表达;JNK和NF-κB信号通路与CD11b调控IL-12的产生关系密切,而p38、ERK信号通路影响较小.因此,研究结果提示,CD11b通过JNK和NF-κB信号通路抑制LPS刺激下巨噬细胞IL-12的产生,抑制CD11b的功能可能有助于削弱LPS引起的炎症反应.     

属离子与镉卟啉络合物的置换反应分光光度法测定地下水中的Mn(Ⅱ)

研究了在咪唑存在下,meso-四(4-羧甲氧基苯)卟啉[TCMOPPH2]和Cd(Ⅱ)所形成的卟啉络合物Cd(Ⅱ)-TCMOPP与Mn(Ⅱ)间的置换反应.结果表明,在弱碱性介质(pH;8.O)中,室温条件下该反应能快速完成,且反应产物Mn(Ⅱ)-TCMOPP立即被水中的溶解氧氧化为Mn(Ⅲ)-TCMOPP卟啉络合物.其最大吸收波长在472.0nm.Mn(Ⅱ)的浓度在1.1～110.0,ng/mL范围内服从比尔定律,桑德尔灵敏度为0.5x10-3μg/cm2.该方法具有一定的选择性,应用于油田地下水中Mn(Ⅱ)的测定,结果满意.     

肺癌A549细胞COX-2与MMP-2表达的关系

目的:探讨肺癌A549细胞环氧化酶-2(COX-2)表达和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达之间可能潜在的关系.方法:①用Western blot法检测对照组和干预组(5、10、15μg/mL脂多糖(LPS)干预12 h,10 μg/mL的LPS干预6、12、24 h)A549细胞MMP-2蛋白质表达;②用ELISA法检测对照组和干预组A549细胞培养上清液COX-2活性产物前列腺素E2(PGE2)及MMP-2的变化.结果:①在5、10、15μg/mL的LPS 12 h诱导下,肺癌A549细胞MMP-2蛋白表达及MMP-2和PGE2的分泌增加;②10 μg/mL的LPS干预肺癌A549细胞6、12、24 h后MMP-2蛋白表达及MMP-2和PGE2的分泌增加;③肺癌A549细胞PGE2与MMP-2正相关(r1=0.980,r2=0.975).结论:①肺癌A549细胞PGE2与MMP-2密切相关;②肺癌A549细胞可能通过激活肺癌A549细胞MMP-2,参与肺癌的侵袭与转移.