海生红藻多管藻中藻胆蛋白的分离纯化

选用Middle Fine Sephadex G-150(MFG-150)、Fine Sephadex G-150(FG-150)以及Sephacryl S-300(S-300)3种凝胶过滤对富含R-藻红蛋白(R-PE)的多管藻藻胆蛋白提取液进行R-PE、R-藻蓝蛋白(R-PC)和别藻蓝蛋白(AP)的分离,并对所得R-PE、R-PC/AP组分用DEAE Sepharose-Fast Flow离子交换层析做进一步纯化,优化建立了从多管藻藻胆蛋白提取液中同时有效分离纯化R-PE、R-PC和AP 3类藻胆蛋白组分的技术方法.     

多管藻中R-藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白的分离纯化

以海生大型红藻多管藻(Polysiphonia urceolata)为材料,建立了从多管藻藻胆蛋白提取液中有效分离纯化藻蓝蛋白(R-PC)和别藻蓝蛋白(AP)的层析技术方法,即先使用Sephacryl S-300(S-300)和Sephacryl S-200(S-200)2种凝胶过滤层析从藻胆蛋白提取液中获得R-PC/AP组分,再依次经过Q Sepharose Fast Flow离子交换层析和Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水层析对凝胶过滤获得的R-PC/AP组分进一步纯化.     

海生红藻多管藻R-藻蓝蛋白亚基组成及特性

以海生大型红藻多管藻(Polysiphonia urceolata)为材料,经Sephadex G-150凝胶过滤和DEAE-Sepharose FF离子交换层析,从藻胆蛋白提取液中分离纯化出在非变性电泳和非变性等电聚焦中均表现单一条带的R-藻蓝蛋白(R-phycocyanin,R-PC),等电点为5.6.SDS-PAGE、变性等电聚焦及二维电泳分析表明,所得R-PC含有1种分子质量为18.2kD、pI为6.5的α亚基α16.85.2,含有分子质量为20.0kD和20.9kD、pI为5.5和5.6的4种β亚基β52.05.0、β52.05.9、β52.06.0和β250..69.该结果为深化R-PC的结构功能研究提供了有价值的实验依据.     

多管藻R-藻红蛋白和R-藻蓝蛋白的制备及其相对分子质量的测定

以海生大型红藻多管藻(Polysiphonia urceolata)为材料,通过凝胶过滤层析、离子交换柱层析、凝胶电泳,得到纯度较高的R-藻红蛋白和R-藻蓝蛋白.在SDS-PAGE中,藻红蛋白表现出4个带有发色团的亚基α、β、β'、γ和γ',其相对分子质量分别为1.73×1041,.95×104,3.33×104和3.10×104;藻蓝蛋白则表现出3个带有发色团的亚基,分别是:α、β和β',其相对分子质量为1.75×1042,.13×104和2.62×104.不同相对分子质量的γ亚基和β亚基的发现都有别于先前的报道,这对藻红蛋白和藻蓝蛋白结构的研究提供了有价值的研究结果.选用Superdex-200凝胶柱层析对纯化的藻红蛋白和藻蓝蛋白进行了相对分子质量测定,藻红蛋白相对分子质量为2.4×105,藻蓝蛋白相对分子质量为1.36×105这表明纯化制备的藻红蛋白和藻蓝蛋白分别以六聚体((αβ)3γ(αβ)3)和三聚体((αβ)3)形式存在.     

分光光度法测定藻胆蛋白含量的研究

从多管藻和螺旋藻中提取了藻胆蛋白,利用藻胆蛋自在可见光区具有吸收的特点,建立了藻胆蛋白含量的快速测定方法．在波长565和620nm处测定藻红蛋白和藻蓝蛋白在0-1．2mg／mL内具有良好的线性关系,r藻红=0．9995,r藻蓝=0．9998,该方法测定藻红、藻蓝蛋白的回收率分别为99．07％和99．11％．与传统的Lowry法相比,该方法测定蛋向质简便快速．重现性好．     

海生红藻R-藻红蛋白和隐藻藻蓝蛋白光吸收系数测定

选用Bradford法和Lowry法,以牛血清蛋白和γ-球蛋白作为标准蛋白,分别对从海生红藻异管藻（Heterosiphonia japonica）和多管藻（Polysiphonia urceolata）以及蓝隐藻（Chroomonas placoidea）中分离纯化的异管藻R-藻红蛋白（HR-PE）、多管藻R-藻红蛋白（PR-PE）、蓝隐藻藻蓝蛋白（Cr-PC）进行了蛋白浓度及其特征吸收峰的光吸收系数测定.根据2种方法和2种蛋白针对3种藻胆蛋白的测定结果以及影响结果的主要因素进行了细致地分析和比较,Lowry法是进行藻胆蛋白,尤其是六聚体藻红蛋白浓度及光吸收系数测定的更适合、准确的检测方法;在进行同类或相同藻胆蛋白之间相对含量、比例的定量分析时,Bradford法是一种更便捷的测定方法.由于藻胆蛋白光吸收系数值与选用的蛋白定量检测方法及其所用的标准蛋白直接相关,在使用和比较藻胆蛋白光吸收系数值时必须明确检测方法和标准蛋白,否则藻胆蛋白光吸收系数值将不具有可比性.     

不同品系地木耳藻胆蛋白含量的比较研究

对6个不同品系地木耳的藻胆蛋白含量进行测定,结果表明：不同产地的地木耳藻胆蛋白含量是存在差异的．采于内蒙古察哈尔右翼前旗的品系不论是藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、藻红蛋白,还是总藻胆蛋白含量在6个品系中都是最高的,而采于陕西榆林的品系则相反,各项含量均为最低．     

层理鞭枝藻的藻蓝蛋白和藻红蓝蛋白α—亚基及其色素肽 …

用紫外可见吸收和圆二色光谱研究了层理鞭枝藻的藻蓝蛋白α－亚基色素肽和藻红蓝蛋白α－亚基色素肽的可逆光化学,这些研究表明藻蓝蛋白α－亚基色素钛和菏红蓝蛋白α－亚基色素肽分别相应于藻蓝蛋白和藻红蓝蛋白的辅基色素结构域,藻蓝蛋白α－亚基色素肽的光谱性质和可逆光化学与藻蓝蛋白α－亚基的相应性质很相似,藻红蓝蛋白α－亚基色素肽的光谱性质和可逆光化学与藻红蓝蛋白α－ 基的相应性质相似,不过藻红蓝蛋白α－亚基色     

重组蓝细菌藻蓝蛋白RpcA共价偶联多种藻胆色素

利用建立的藻胆蛋白大肠杆菌异源表达系统,证明了Synechococcus sp.WH8102的藻蓝蛋白α亚基RpcA能分别结合蓝细菌中的4种藻胆素.裂合酶RpcG利用PCB或PEB做色素底物,连接它们到RpcA上,并伴随着异构作用,分别生成色素蛋白PVB-RpcA、PUB-RpcA;但裂合酶CpcE/CpcF利用PCB或PEB做色素底物,连接它们到RpcA上,则分别生成了色素蛋白PCB-RpcA、PEB-RpcA.后者荧光量子产率较高.2种裂合酶使用2种不同的色素底物,可以产生4种完全不同的、仅偶联到RpcA的色素蛋白.RpcG和CpcE/CpcF的对比研究可以探讨裂合酶异构功能的结构基础.同时这些色素蛋白有潜在的应用价值,可以作为生物学荧光探针。     

藻蓝蛋白裂合酶基因的表达与酶活性研究

为了比较研究层理鞭枝藻藻蓝蛋白裂合酶PcE／F与藻红蓝蛋白裂合／异构酶PecE／F的结构与功能,将藻蓝蛋白裂合酶PcE／F氨基酸序列与其他蓝藻的相应序列进行比较,并进行大量表达,将表达的裂合酶PcE／F用于藻蓝胆素(PCB)与藻蓝蛋白α-亚基(α-PC)脱辅基蛋白(PcA)的体外重组,得到天然活性的α-PC,从而表明层理鞭枝藻中pcE／F所编码的蛋白质是α-PC生物合成的裂合酶．     

Ni元素对铜绿微囊藻的生长、光谱特性及藻胆蛋白含量的影响

 为了探讨微量元素对蓝藻水华生消的影响及其机理,研究了不同浓度Ni对铜绿微囊藻生长、光谱特征及藻胆蛋白含量的影响,结果表明:Ni元素对铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa 905)的生长、光谱特性及藻胆蛋白含量均有影响.①Ni元素在低质量浓度(<0.10μg/mL)下促进藻细胞生长,高质量浓度(0.30～1.00μg/mL)下抑制其生长;②Ni元素处理使藻细胞吸收光谱峰位红移、吸光值降低,表明Ni元素使叶绿素和藻胆蛋白变性,抑制了藻细胞的吸光能力;③Ni元素在较低质量浓度(<0.30μg/mL)下使藻胆蛋白的吸收峰值升高,在较高质量浓度(0.40～1.00μg/mL)下则使其降低;④Ni元素在低质量浓度(<0.30μg/mL)下会使藻蓝蛋白(PC)含量增加,高质量浓度(0.40～1.00μg/mL)下则使其减少;不论在高质量浓度还是低质量浓度下,均使别藻蓝蛋白(APC)含量减少.     

螺旋藻藻蓝蛋白提取及稳定性试验

藻蓝蛋白可用于配制化妆品及各种天然食品或荧光探针标记．本研究用氯化钾溶菌酶法或冻融法破碎螺旋藻细胞壁,盐析,提取藻蓝蛋白,并对其理化特性进行了测定．表明酶法破壁适应于大量藻蓝蛋白制备,冻融法只适应于小量制备．提取率为１３％左右,提取藻蓝蛋白在４０℃以下及ｐＨ４．０～８．５之间表现稳定,４５℃以上有变色现象,荧光性减弱,糖溶液可提高藻蓝蛋白对热的稳定性,光照对藻蓝蛋白影响较小     

不同来源钝顶螺旋藻藻蓝蛋白特性比较

 为更大程度地开发利用鄂尔多斯螺旋藻藻蓝蛋白资源,获得螺旋藻藻蓝蛋白提取及保存过程中的最佳参数,对2 藻种藻蓝蛋白硫酸铵盐析饱和度、热稳定性、酸碱稳定性进行了比较。结果显示,在硫酸铵饱和度达到40%时,2 藻种藻蓝蛋白纯度和藻蓝蛋白提取率均达到最高,且鄂尔多斯钝顶螺旋藻藻蓝蛋白纯度为引进钝顶螺旋藻的1.67 倍,两者的提取率持平。鄂尔多斯螺旋藻藻蓝蛋白对温度较引进种敏感,除25℃时相差不大外,35、45、55℃等条件下均表现出相比引进种更大的纯度降低率,多数为后者的两倍,但即使鄂尔多斯钝顶螺旋藻纯度降低率较大,降低后的纯度仍然比引进种最高纯度大,显示出鄂尔多斯钝顶螺旋藻在藻蓝蛋白上的优势。在工艺及环境条件允许的情况下,提取鄂尔多斯钝顶螺旋藻藻蓝蛋白时,尽量保持在较低温度下操作,如果兼顾提取率和纯度,宜选择55℃以内操作。2 藻种藻蓝蛋白酸碱稳定性上表现出较一致的反应,pH 值5~6 可以保持藻蓝蛋白的最大纯度。     

水提分离钝顶螺旋藻藻蓝蛋白及其稳定性研究

应用水提法分离钝顶螺旋藻藻蓝蛋白后,考察了螺旋藻细胞破碎液的藻液比、盐离子浓度、pH和环境温度等对藻蓝蛋白分离的影响,并对藻蓝蛋白的耐热性能及耐酸碱性能进行了研究.结果表明：用藻液比为5 g/L及50%（NH4）2SO4进行盐析沉淀,提取藻蓝蛋白的收率可达62.4 mg/g藻粉;螺旋藻藻蓝蛋白在常温时保持稳定,在较高温度时稳定性下降;在中性溶液环境时,藻蓝蛋白的稳定性良好,偏酸或偏碱环境均改变螺旋藻藻蓝蛋白的性能.     

滇池微囊藻“水华”藻胆蛋白资源化研究

对从滇池采集的惠氏微囊藻（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓｗｅｓｅｎｂｅｒｇｉｉ（惠氏微囊藻的多率达９０％以上）和人工养殖螺旋藻的藻胆蛋白和粗蛋白进行了比较研究,结果显示,滇池微囊藻水华中藻胆蛋白的含量占干藻的１５．０７％晒干后的螺旋藻其藻胆蛋白含量８．０５％,喷雾干燥的３．６８％,此外,超滤前破细胞的溶液含小白鼠致死的毒素,超滤提取得到的藻胆蛋白结果为阴性,藻胆蛋白的安全性好。     

螺旋藻藻蓝蛋白萃取条件的响应曲面优化

藻蓝蛋白具有较高的营养和医用价值,为进一步提高其萃取效率,本研究通过响应曲面(response surface methodology,RSM)的方法,对螺旋藻藻蓝蛋白的萃取条件进行优化.结果表明,萃取时间和萃取温度的交互作用对藻蓝蛋白得率的影响最为显著;而实验所得模型的拟合性较好(R2=0.955 0),得到的最佳萃取工艺条件为:质量浓度为2.0mg/mL、萃取时间为37.14h、萃取温度为25.61℃,在此萃取条件下得到的藻蓝蛋白得率为13.66%,较优化前提高了32.8%,与模型预测值13.72%接近.     

钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白的分离纯化及特性研究

为发展新型海洋药物,采用ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－２００凝胶层析和羟基磷灰石柱层析对人工养殖钝顶螺旋藻中的藻蓝蛋白进行了分离和纯化,得到了藻蓝蛋白纯品。测定了藻蓝蛋白的氨基酸组成和含量。藻蓝蛋白的紫外、可见吸收光谱表明其最大特征吸收波长为２７８,３６０,６２０ｎｍ。得到的藻蓝蛋白经等电聚焦显示为一条带,其等电点为ｐＨ＝４．３。还测量了藻蓝蛋白红外吸收光谱。研究所获得的藻蓝蛋白为后续开展临床应用提供了可靠的样品。     

藻胆蛋白表达条件优化的研究

为了提高藻胆蛋白的表达含量,对本实验室构建的含pACYCDuet-ho1-pcyA、pETDuet-pecE-pecF、pCO-LADuet-pecA的E.coliBL21菌种的表达条件进行优化。通过单因素实验和正交实验L9（33）优化了蛋白的表达条件为：诱导表达温度为28℃,诱导表达时间为14h,诱导剂量为1.0mmol/L,藻胆蛋白最高表达含量为11.271mg/100mL.     

钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的提取工艺优化及其纯化研究

以钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)藻蓝蛋白(Phycocyanin)的纯度和回收率为指标,考察溶胀法和冻融法中不同破壁影响因素及活性炭吸附法中活性炭目数、活性炭加入量和吸附时间对藻蓝蛋白粗提的影响,并结合响应面分析法优化提取工艺参数,得到最优破壁条件和活性炭吸附条件。结果表明,溶胀法最优提取条件为料液比1∶50(g/mL),溶胀时间24h,溶胀次数2次,测得藻蓝蛋白纯度为0.47,得率为2.17%;冻融法最优提取条件为料液比1∶50(g/mL),冷冻时间8h,冻融次数2次,测得藻蓝蛋白纯度为0.34,得率为2.19%。活性炭吸附法最优工艺条件为300目活性炭,活性炭加入量0.7g/20mL,吸附时间10min,藻蓝蛋白纯度为0.80,回收率为73.23%。疏水层析法纯化得到食品级藻蓝蛋白(纯度P≥0.7)和医药级藻蓝蛋白(纯度P≥3.0),总回收率为61.15%。因此,溶胀-活性炭吸附-疏水层析三步提纯藻蓝蛋白工艺合理可行,实现了医药级藻蓝蛋白的分离提纯,降低了工业生产成本,具有实用价值。     

蓝隐藻藻蓝蛋白的分离、纯化及性质研究

以实验室培养的蓝隐藻(Chroomonas placoidea)为材料,经过压力破碎和高速离心分离去除膜成分,得到的上清液分别采用50%、70%、80%、90%和100%的硫酸铵分级沉淀.沉淀经2次葡聚糖Sephadex G-100层析,得到了纯化的藻蓝蛋白,并对各级藻蓝蛋白的吸收光谱、荧光谱、亚基组成进行了分析.结果显示,隐藻藻胆蛋白呈现出很宽的硫铵沉淀范围,但各种沉淀样品具有几乎相同的光谱特性和相似的亚基组成,说明其不同的水溶性质可能与其亚基聚合程度不同有关;得到的藻蓝蛋白经HPLC和中性PAGE检测,基本不含杂质,A645/A280比值最高可达7以上.结果为今后的研究和应用奠定了基础.