Nelin的肌动蛋白结合特性及与其相互作用

为了研究人新基因nelin及其心肌表达产物Nelin蛋白的生物特性, 并寻找能够与其发生相互作用的蛋白质, 对Nelin蛋白的全长及其部分结构域进行了肌动蛋白结合共沉淀实验, 并在真核细胞内进行了免疫荧光共定位实验. 结果发现, 在体外共沉淀和细胞内共定位实验中Nelin均表现出同肌动蛋白相结合的能力. 进一步采用酵母双杂交的方法将Nelin与人心脏cDNA文库进行杂交筛选, 得到了3个阳性克隆分别为细丝蛋白(Filamin)C亚型、肌联蛋白(Titin)N2B亚型和a胰蛋白酶抑制物重链前体 (ITIH). 通过免疫共沉淀实验, 验证了Nelin能够同Filamin的羧基末端免疫球蛋白样结构发生相互作用. 通过上述实验证明了Nelin为一个新的肌动蛋白结合蛋白, 并且能够同Filamin相结合. 由此推论新基因nelin的心肌表达产物Nelin是一个细胞骨架相关蛋白并且很可能作为一个膜-细胞骨架连接蛋白, 起到了参与细胞黏着斑形成的过程.     

导致心脏猝死的基因缺陷

一种在剧烈运动时导致猝死的心脏遗传缺陷病现在已可通过验血而得到鉴定。这种遗传缺陷病称为肥大性心肌病,其结果是心肌增厚。这是年轻人,特别是运动员发生突然性心脏死亡的最常见病因。这种遗传突变发生在第14染色体的肌球蛋白基因上。肌球蛋白是组成心肌的两种主要蛋白之一,是人体肌肉中最丰富的蛋白。它同肌动蛋白一起,负责着肌肉的收缩和放松。美国休斯敦贝勒医学院的阿利·马利安说:“肌球蛋白是一种同其他蛋白相互作用的复杂蛋白。”他认为这种遗传缺陷可以改变肌球蛋白的导电性质,从而改变它的功能并影响它与肌动蛋白相互作用的方     

衣藻肌动蛋白-绿色荧光蛋白的融合基因在烟草悬浮细胞中的表达及融合蛋白的体外聚合

将衣灌（Chlamydomonas reinhardtii)肌动蛋白（actin）基因(cDNA)与绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP)基因融合后,分别构建到原核和植物表达载体中,并在BL21plus细菌和烟草悬浮细胞（BY-2）中进行表达。通过荧光显微镜观测到重组后的融合蛋白在菌体和烟草悬浮细胞中得到正确表达。肌动蛋白-绿色荧光蛋白 的融合蛋白主要分布在烟草悬浮细胞细胞膜周围,参与膜骨架的组成,另外还大量分布于细胞核周围和细胞板的位置,同时也在细胞内形成丝状结构,参与F-actin的组成。将肌动蛋白-绿色荧光蛋白融合基因的原核表达产物经过硫酸铵分级沉淀、离子交换层析和疏水柱层析后,得以纯化,并在纯化产物中加入肌动蛋白聚合缓冲液,纯化的肌动蛋白能聚合成为丝状结构即F-actin,这表明低等藻类的肌动蛋白具有同高等植物和动物相似的性质和功能。     

蛋白复合物与相互作用谱和表达谱的相关性分析

蛋白相互作用是指细胞内蛋白-蛋白间的物理相互作用, 通过酵母双杂交系统和基于质谱的蛋白吸附沉淀技术, 在酵母细胞中获得了大规模的蛋白相互作用数据. 收集了文献报道的共2617个酵母蛋白的11855条相互作用. 通过分析酵母细胞的大规模基因表达谱数据, 获得不同基因间表达的相关性. 蛋白复合物数据也可以获得, 并能转换成蛋白两两关系数据. 综合分析蛋白复合物、蛋白相互作用数据和基因表达数据可以发现三者之间的相关性. 结果显示, 有相互作用或表达谱相似的蛋白都比随机抽取的蛋白同属一蛋白复合物的几率高; 并且, 有相互作用且表达谱相似的蛋白同属一蛋白复合物的几率更高. 这一研究表明, 对现有的大规模蛋白复合物数据、蛋白相互作用数据和基因表达谱数据进行整合、分析, 可以揭示它们之间的关联性, 并且有助于获得这些数据蕴含的公共信息. 这种研究方法对于其他的大规模数据, 如蛋白组数据、表达谱数据、蛋白的细胞定位数据和表型数据的综合分析有很好的借鉴意义.     

细胞骨架与早期基因mRNA定位的相关性研究

近年来利用高压电子显微镜、组化、生化和冰冻蚀刻等技术发现了一些mRNA,多聚核糖体及蛋白转译延伸因子在细胞骨架上的定位。蛋白转译机构在细胞骨架上的定位,提示细胞骨架可能与基因表达有关。早期基因c-jun,c-fos,c-mys的产物都是转录因子,对Go至S期有重要调节作用。Zambetti等发现微丝解聚剂——细胞松弛素D（Cytochalasin D,CD）可刺激Hela细胞。c-fos的转录活性,并发现问期细胞中80％的c-fos mRNA与细胞骨架相结合,而CD处理使微丝解聚后,70％以上的mRNA出现在可溶相中, 但微丝解聚剂对C-jun,C- myc的转录活性是否有影响,其mRNA是否与细胞骨架相结合,迄今尚未见报道,本文利用     

Dystrophin基因3′末端一个新的725kb SfiI片段的发现

Dystrophin是人类第一个用反向遗传学(Reverse genetics.)方法分离到的巨大蛋白质,分子量达430kD,主要分布于哺乳动物的骨骼肌、心肌、平滑肌、脑等组织的细胞膜上,目前被认为是一种细胞骨架蛋白。Dystrophin基因定位于Xp21.;据报道,该基因     

JWA蛋白在细胞内与α-微管蛋白的共定位

探讨了JWA在细胞内的分布特征, 特别是在有丝分裂过程中的动态变化及与α-微管蛋白的关系. 用免疫共沉淀方法研究JWA与α-微管蛋白的相关性; 用基因转染技术研究JWA蛋白高表达后JWA蛋白和α-微管蛋白的相互关系; 用荧光显微镜技术研究低温处理、药物阻滞细胞周期、JWA反义寡核苷酸处理的PC12细胞JWA蛋白和α-微管蛋白的相互作用; 分别用流式细胞仪分析和激光共聚焦技术检测PC12细胞的各细胞周期蛋白在细胞内的分布. JWA作为一种新的微管相关蛋白, 在微管动力学变化过程和细胞周期不同阶段与α-微管蛋白分布平行, 可能对微管具有稳定作用.     

fibrillarin在有丝分裂过程中分布于纺锤体两极

fibrillarin是核仁的一个主要蛋白成分，细胞分裂时它要经历从核仁到细胞质的重新分布过程，并且与细胞分裂后核仁的重新组装有着密切的关系。为了研究有丝分裂过程中fibrillarin的动态变化及与其他细胞结构的关系，构建了fibrillarin的真核表达载体，采用cDNA转染，免疫荧光标记和免疫共沉淀等方法证明了处于分裂期的HeLa细胞中fibrillarin不但分布于细胞质，而且还有一部分定位于纺锤体两极的中心体部位，并且与与NuMA蛋白共定位，当使用药物将分裂期细胞的微管结构解聚后，fibrillarin在两极聚集的现象消失，而后随着纺锤体的重新组装，fibrillarin又在两极重新出现，体外非细胞体系的实验也证明了fibrillarin和分裂期细胞中微管中心体结构结合在一起。     

豌豆肌动蛋白异型体(PEAc1)与绿色荧光蛋白融合基因的原核表达与特性分析

肌动蛋白普遍存在于真核生物细胞中, 并在细胞生命活动中发挥重要作用. 在细胞中, 肌动蛋白多以异型体(isoform)形式存在. 植物肌动蛋白异型体的大量获得和理化特性分析一直是一个难题. 对豌豆肌动蛋白异型体PEAc1与组氨酸标签(His-tag)、绿色荧光蛋白(GFP)进行了基因融合和原核表达. 通过脲变性、梯度脲透析复性、镍柱亲和层析的方法从包涵体中纯化出大量、高纯度的PEAc1-GFP融合蛋白(> 2 mg/L培养物). 理化特性分析表明, 它同鸡骨骼肌肌动蛋白一样, 单体PEAc1-GFP能与DNaseⅠ结合并显著抑制后者酶活性; 单体PEAc1-GFP能聚合成带有绿色荧光的丝状结构; 聚合的PEAc1- GFP能被微丝的特异标记物鬼笔环肽(phalloidin)标记; PEAc1-GFP与鸡骨骼肌肌动蛋白的聚合曲线趋势基本一致, 聚合临界浓度为0.24 μmol/L; 聚合的PEAc1-GFP能激活肌球蛋白Mg-ATPase活性, 其激活比率随浓度的增加而增加, 在1 mg/mL浓度下, 能激活4倍以上. 上述结果表明, 带有组氨酸标签和GFP标记的PEAc1表现出和天然肌动蛋白相似的理化特性; 基因融合、原核表达、变性、复性及亲和纯化是获得大量高纯度植物肌动蛋白异型体的有效方法.     

长肌球蛋白轻链激酶的5DFRXXL序列促使肌动蛋白聚集成束

长肌球蛋白轻链激酶(L-MLCK)含有5个DFRXXL序列, 可与丝状肌动蛋白(F-actin)结合. 结合动力学结果提示, 一个DFRXXL序列可与F-actin中的一个单体结合, 但其生物学意义仍不清楚. L-MLCK的5DFRXXL序列既然含有多个actin的结合位点, 推测有可能它通过该序列发挥一个F-actin成束蛋白的作用. 为此, 体外表达并纯化了HA标记的重组5DFRXXL蛋白, 并通过结合动力学实验分析了重组5DFRXXL蛋白与肌丝或F-actin的结合特征, 结果表明, 重组5DFRXXL蛋白与F-actin和肌丝均具有较高的亲和力, 其中与肌丝的结合常数K_D为0.45 μmol/L, 与F-actin的结合常数为0.41 μmol/L. 通过交联实验发现, 重组5DFRXXL蛋白可以有效地交联F-actin并使其形成大分子聚集物. 应用激光共聚焦和电子显微镜方法观察到该聚集物具有典型的F-actin蛋白束结构. 将5DFRXXL的表达质粒转染真核细胞后, 可见5DFRXXL能促使细胞边缘的“微绒毛”结构形成, 可能与5DFRXXL聚集F-actin的活性有关. 这些结果表明, L-MLCK除能通过其磷酸激酶活性控制细胞收缩外, 还可能作为一个新的F-actin成束蛋白影响细胞骨架形成.     

细胞核内肌动蛋白及其功能研究进展

肌动蛋白是细胞内含量丰富的蛋白质. 近年来, 肌动蛋白已被证实普遍存在于各类细胞的细胞核中. 肌动蛋白、肌动蛋白结合蛋白和肌动蛋白相关蛋白等蛋白共同参与了细胞核内肌动蛋白形式和功能的调节, 包括肌动蛋白单体与聚合形式的转换、染色质结构调整、基因转录调控、mRNA加工和运输等许多重要生理功能. 综述了细胞核内肌动蛋白及其功能的研究进展.     

兔出血症病毒衣壳蛋白与次级结构蛋白的相互作用

用真核细胞双杂交系统、免疫共聚焦技术和免疫共沉淀等方法,对兔出血症病毒(RHDV)的衣壳蛋白(VP60)和次级结构蛋白(VP10)在细胞内、外的相互作用进行了分析和鉴定.结果显示,RHDVVP60与VP10两种蛋白之间存在较强的相互作用,将VP60截为两大段后,其间的相互作用明显减弱,提示二者之间的相互作用依赖于衣壳蛋白结构的完整性.本研究将为进一步研究RHDV病毒颗粒的装配机制等提供有益线索.     

从花粉肌动蛋白到作物雄性不育

肌动蛋白在动植物细胞的生命活动中担负着重要任务. 花粉细胞中含有丰富的肌动蛋白,其结构及性质与动物肌动蛋白极其相似. 植物肌动蛋白基因的碱基序列及氨基酸序列与动物的序列亦极为相似. 植物细胞质雄性不育系植株的花粉比其保持系花粉中的肌动蛋白含量低得多. 在植物发育过程中肌动蛋白基因的表达有明显的器官特异性,在花粉中的表达量比根、茎、叶中高得多. 构建了肌动蛋白反义基因的表达质粒,转移到小麦和番茄原生质体中,以抑制花粉中肌动蛋白基因的表达,从而获得雄性不育植株. 转基因植株花粉中的肌动蛋白明显减少,而雌芯却不受影响. 此项研究为培育作物雄性不育系开辟了新途径.     

一种新的微管相关蛋白JWA对细胞内氨基酸平衡有重要调节作用

探讨了JWA蛋白在细胞内的确切定位、与微管蛋白的相互关系及对细胞内氨基酸平衡的调节作用. 应用4~37℃(微管解聚-聚合)交替作用法提取纯化大鼠脑组织中微管及其相关蛋白; 用免疫共沉淀法研究JWA蛋白与微管蛋白的相互作用; 应用基因转染和免疫荧光等实验方法研究低温(4℃)、秋水仙素(1 × 10^-5, 5 × 10^-5 mol/L)等处理的HBE细胞/ NIH3T3细胞中JWA和微管的动态变化及相互关系. 应用反义寡核苷酸技术结合氨基酸分析技术探讨JWA蛋白对PC12细胞内氨基酸平衡的调节作用. 结果表明, JWA蛋白是一种新的微管相关蛋白, 与微管蛋白分布基本平行, 在绝大多数情况下伴随微管动力学改变(聚合或解聚)而同步发生变化, 并且可能参与了细胞有丝分裂的过程. JWA蛋白是细胞内氨基酸总量的一种重要负性调节蛋白, 并选择性地调节细胞内谷氨酸和牛磺酸含量.     

铁离子对肌动蛋白聚合的影响

肌动蛋白(Actin)是细胞骨架蛋白之一.在一定的条件下其球状单体(G-actin)可以聚合为丝状聚合体(F-actin).细胞的形态学变化及游动性与此特性有关.已经证明一些金属离子(如K~+,Mg~(2+),Ca~(2+))在ATP存在下可引发肌动蛋白的聚合.我们曾报告Fe(Ⅱ)离子可引起体外培养的软骨细胞形态发生明显变化,并伴有细胞功能的变化.用鬼笔环肽标记方法观察到Fe(Ⅱ)作用于细胞骨架,使细胞骨架微丝系统发生了解组与重组.为了进一步研究Fe(Ⅱ)离子与细胞微丝的相互作用,探讨软骨细胞形态与功能之间的关系.本文利用从兔腿肌肉分离纯化的肌动蛋白,研究了Fe(Ⅱ)离子对肌动蛋白聚合过程的影响.1材料和方法1.1试剂三磷酸腺苷(ATP)购自Sigma公司,叠氨化钠(N_aN_3)和三羟甲基氨基甲烷(Tris)为进口分装试剂;其余均为国产分析纯试剂.1.2肌动蛋白的分离与纯化参照文献[4]方法由兔腿肌肉分离提取丙酮干粉(-15℃可保存数月).取一定量丙酮干粉经离心、盐析及透析等步骤分离并纯化得G-actin.G-actin溶解在缓冲溶液G(2mmol/LTris-HCI,0.2mmol/L ATP,0.5mmol/L二巯基乙醇,1.5mmol/L NaN_3,pH=8.0)中在4℃下放置两周无明显聚合.由紫外分光光度法(A_(290))确定G-actin含量.     

同源于hMIP-1a 的vMIPa 对人趋化因子受体的作用

HIV感染靶细胞须以人CD4+白细胞膜上的趋化因子受体为共受体, 与此共受体结合的趋化因子类似物可阻止HIV进入靶细胞. 实验目的是了解与人趋化因子单核细胞炎性蛋白-1a (MIP-1a)同源的人疱疹病毒8 K6基因编码产物vMIPa 是否具有结合人趋化因子受体的功能. 首先用蛋白质同源分析及蛋白空间结构模拟等对比vMIPa与人趋化因子的结构异同, 用PCR扩增出K6片段, 克隆于哺乳类细胞表达载体, 转染于NIH3T3细胞, 得到条件培养液. 然后将K6基因在大肠杆菌中表达, 得表达产物vMIPa. 结果显示转染K6的NIH3T3细胞含有vMIPa单一分子量的mRNA, 此转染细胞的条件培养液及大肠杆菌表达纯化的vMIPa可与人趋化因子125I-hMIP-1a竞争结合外周血单核细胞的CCR5受体, 而且此条件培养液及vMIPa不引起外周血单核细胞对ICAM-1的黏附反应. 研究证实K6编码产物vMIPa与CCR5结合但不引起细胞黏附反应, 即封闭HIV的CCR5共受体, 提示有用于防治HIV/艾滋病的可能性.     

同源于hMIP-1α的vMIPα对人趋化因子受体的作用

HIV感染靶细胞须以人CD4+白细胞膜上的趋化因子受体为共受体, 与此共受体结合的趋化因子类似物可阻止HIV进入靶细胞. 实验目的是了解与人趋化因子单核细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)同源的人疱疹病毒8 K6基因编码产物vMIPα是否具有结合人趋化因子受体的功能. 首先用蛋白质同源分析及蛋白空间结构模拟等对比vMIPα与人趋化因子的结构异同, 用PCR扩增出K6片段, 克隆于哺乳类细胞表达载体, 转染于NIH3T3细胞, 得到条件培养液. 然后将K6基因在大肠杆菌中表达, 得表达产物vMIPα. 结果显示转染K6的NIH3T3细胞含有vMIPα单一分子量的mRNA, 此转染细胞的条件培养液及大肠杆菌表达纯化的vMIPα可与人趋化因子125I-hMIP-1α竞争结合外周血单核细胞的CCR5受体, 而且此条件培养液及vMIPα不引起外周血单核细胞对ICAM-1的黏附反应. 研究证实K6编码产物vMIPα与CCR5结合但不引起细胞黏附反应, 即封闭HIV的CCR5共受体, 提示有用于防治HIV/艾滋病的可能性.     

SGK和14-3-3蛋白与TPO/MPL信号传导的丝氨酸/苏氨酸磷酸化机制有关

血小板生成素(thrombopoietin, TPO)是调节血小板生成最主要的细胞因子, 它的生物学效应由其受体c-Mpl介导. 用酵母双杂合系统(two-hybrid system)筛选了与c-Mpl膜内部分相互作用的蛋白质. 在5×106个转化子中, 得到48个阳性克隆. 测序结果表明, 其中一个是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶SGK (serum and glucocorticoid-inducible kinase)的部分编码序列(编码第246位氨基酸至C末端, 包括3′端非编码区); 另一个为14-3-3 theta亚型蛋白的部分编码序列(编码第67位氨基酸至C末端, 包括3′端非编码区). 体外GST-Pulldown分析和免疫共沉淀进一步证实了c-Mpl与它们的相互作用. 通过系列缺失研究发现两个蛋白与c-Mpl相互作用的区域都在523~554 aa范围内. 用酵母双杂合系统进一步研究SGK和14-3-3蛋白之间的关系, 发现两者可能直接相互作用. SGK和14-3-3蛋白可能与TPO/MPL信号传导过程中的丝氨酸/苏氨酸磷酸化有关.     

转移消失蛋白研究进展

转移消失蛋白(missing in metastasis,MIM)是一种重要的胞内膜调控蛋白,属于inverse BAR(I-BAR)家族成员,能结合细胞膜并在细胞极化、运动和内吞作用等过程中发挥调节功能,其表达异常与多种疾病尤其是肿瘤发生或转移相关,在神经系统、循环系统和生殖泌尿系统中也有一定作用.MIM蛋白的生物学功能包括调节肌动蛋白细胞骨架、与皮动蛋白等其他蛋白相互作用、参与细胞信号通路调控、改变细胞膜形态并促进细胞极化等,在结构上表现出典型I-BAR家族成员特征,借助其N端的I-BAR区域自聚合形成二聚体,促使细胞膜形成伪足状突起,甚至可以调控人造磷脂囊泡,但二聚体的形成也可被靶向的多肽等抑制剂阻断.除作用于蛋白I-BAR,RPTP结合域的特异性多肽外,MIM也可被RNAi干涉,在肿瘤生物治疗领域具有开发潜力.本文回顾了MIM蛋白相关医学研究进展,综述了MIM蛋白已知的生物功能,分析了MIM蛋白靶向治疗及其他应用前景,并提出了可能的研究新方向、新思路.     

类DnaJ蛋白基因sll1384参与集胞藻PCC 6803的趋光反应

在集胞藻PCC 6803中, 基因sll1384编码的蛋白在N端含有一个DnaJ结构域, C端含有一个TPR结构域. sll1384突变株对不同温度的适应能力同野生型没有区别, 但其趋光运动能力几乎丧失. 将野生型sll1384基因导入突变株后, 可恢复其向光运动. 电子显微镜观察发现, 突变株细胞表面的纤毛与野生型没有明显区别. 突变株的转化效率也与野生型相同, 推测Sll1384通过与其他蛋白相互作用调节集胞藻的趋光反应. 这是在蓝藻中发现的第一个影响趋光反应的类DnaJ蛋白基因.