人FOXA1蛋白的原核表达、纯化及蛋白互作分析

构建FOXA1的原核表达载体,诱导表达并纯化后获得人FOXA1的C端和N端蛋白片段,为寻找FOXA1的互作蛋白提供材料基础.提取人乳腺癌细胞MCF7的总RNA,逆转录成cDNA,设计引物PCR克隆FOXA1的cDNA,再以此为模板扩增FOXA1的C端、N端cDNA片段,分别并克隆进带有GST标签的原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达质粒.双酶切及测序鉴定正确后,转化至大肠杆菌BL21Rosetta DE3,经IPTG诱导,Glutathione Sepharose 4B亲和纯化,通过SDS-PAGE电泳及Western blot确定FOXA1蛋白的表达.与MCF7细胞裂解液孵育,进行GST-Pull down试验,检测纯化蛋白与FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.成功构建pGEX-4T-1-FOXA1-C和pGEX-4T-1-FOXA1-N的原核表达载体;在大肠杆菌中诱导目的蛋白表达;经Glutathione Sepharose 4B纯化后,获得了人FOXA1的C端蛋白片段GST-FOXA1-C与N端蛋白片段GSTFOXA1-N;证实GST-FOXA1-C能与FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.     

人神经营养素-4基因的原核表达与纯化

以人外周血淋巴细胞基因组DNA为模板,用PCR方法扩增出神经营养素-4基因(NT-4)成熟蛋白的DNA序列,并将其克隆到表达载体pET32a中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经异丙基-β-D-半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导后高效特异表达了分子量约为35kD的蛋白,诱导表达的蛋白主要存在于包涵体中,经Ni^2 -NTA树脂亲和层析纯化,得到了纯度达94％的NT-4成熟蛋白的融合蛋白．为进一步研究NT-4的生物学活性及在临床治疗中的作用打下了基础．     

拟南芥转录因子TDF1的原核表达及多克隆抗体制备

在拟南芥花药发育过程中,MYB家族转录因子TDF1在调控绒毡层发育及后期功能上起到关键的作用．利用PCR方法扩增TDF1基因并克隆到原核表达载体pET-32a．将表达载体TDF1-pET32a转入大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG成功诱导表达了分子量约为56KD的TDF1融合蛋白．该融合蛋白主要以包涵体形式存在,分离出包涵体后进行可溶性处理作为抗原免疫家兔．制备出的多克隆抗血清经ELISA测定效价为1：2560,Westernblot检测表明该抗血清与TDF1融合蛋白识别良好．TDF1抗体的制备有助于进一步从生化水平上研究TDF1在花药发育中的功能．     

拟南芥NOA1蛋白的原核表达和分析

通过构建AtNOA1的GST融合表达载体,在E.coli中表达AtNOA1蛋白,并分析不同诱导条件对AtNOA1蛋白表达的影响.结果表明,22℃是AtNOA1表达的最适诱导温度,而IPTG浓度在一定条件下变化对AtNOA1表达量无明显影响.     

PMEPA1蛋白的原核表达、纯化及其抗体制备

为了从蛋白水平上检测前列腺跨膜蛋白PMEPA1(prostate transmembrane protain,androgen induced 1)在细胞内的表达和功能,构建了原核表达重组质粒pTrcHisA-PMEPA1和pGEX4T-2-PMEPA1,转化大肠杆菌BL21-RIPL后,IPTG诱导蛋白表达,分别用Ni-NTA和谷胱甘肽琼脂糖凝胶层析柱纯化蛋白。用His-PMEPA1免疫兔子制备抗体,并用GST-PMEPA1对抗体进行纯化。免疫印迹检测显示抗体能够特异识别细胞中内源PMEPA1蛋白。     

pEGX-4T-2/NAP1融合蛋白的原核表达及鉴定

以鼻咽组织cDNA为模板,PCR扩增NAP1基因编码区,PCR产物克隆入pUCm-T载体,筛选阳性克隆. 构建NAP1基因编码区的原核表达载体pEGX-4T-2/ NAP1,转化大肠杆菌BL21. 经IPTG诱导表达后,在不同时段收集菌体,提取细菌的全部蛋白. 经12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,发现细菌全蛋白中在35 KD～36 KD处多出一条明显条带. 用兔抗人NAP1多克隆抗体,利用Western Blotting对该融合蛋白的表达进行了鉴定,NAP1基因的融合蛋白表达成功,为制备NAP1单克隆抗体和获得有生物活性的NAP1蛋白,进一步研究NAP1蛋白的功能奠定了基础.     

人CDK4基因的原核表达及重组蛋白的纯化和复性

将人CDK4基因克隆入原核表达载体pET28a（+）中, 经 酶切和测序鉴定正确的重组质粒pET28a-CDK4, 转化E.coliBL21(DE3)后获得表达菌株. 该表达菌株经IPTG诱导后, 高效表达出带有组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白, 表达量占菌体总蛋白的52.6%, 包涵体经过洗涤、 尿素变性溶解、 His Trap HP Kit柱纯化、 稀释复性, 获得纯度达98%以上的蛋白. SDS-PAGE及Western blot分析表明, 在分子量34 000处有一特异性蛋白条带. 结果表明, 已成功的表达和纯化纯度达98%的重组人CDK4蛋白.     

HPV23 L1蛋白的表达、纯化及活性鉴定

为了制备人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)23亚型的L1蛋白,结合大肠杆菌密码子偏好性,经密码子优化合成HPV23的L1蛋白编码区序列,并将其分别克隆至原核表达载体,成功构建了4种原核表达载体pET28a-23L1、pET30a-23L1、pET32a-23L1和pESUMO-23L1,随...     

猪白细胞介素-6基因的原核表达及其活性研究

用DNA重组技术，将已克隆的猪IL－6 cDNA片段插入pGEX-1λT质粒，转化大肠杆菌，以BamHI和Pst I酶切鉴定重组子，以IPTG诱导融合蛋白表达，并作RT－PCR及SDS－PAGE分析表达情况，从聚丙烯酰胺制备凝胶中回收融合蛋白，用MTT法测定重组蛋白刺激小鼠脾淋巴母细胞增殖反应的活性，并免疫家兔制备高免血清，得到高效表达猪IL－6的质粒pGPIL-6,RT-PCR确证pGPIL-6在大肠杆菌中能正确转录，经SDS－PAGE分析表达蛋白分子量为49kD，融合蛋白具有较高的促小鼠淋巴细胞增殖反应活性，以此免疫家兔，可制备滴度为1：128 000的兔高免血清。     

水稻OsAAA1蛋白的原核表达载体构建及其可溶性表达研究

为使用外源表达载体表达并纯化有活性的水稻ATP酶蛋白Os AAA1,构建了p ET-32a-Os AAA1原核表达载体并进行体外IPTG诱导表达和Ni+柱亲和层析纯化.利用SDS-PAGE和Western Blot检测了目的蛋白.结果表明:将成功构建的p ET-32a-Os AAA1原核表达载体,转化到大肠杆菌Origami菌株后,在70~100 KD之间检测到可溶性目的蛋白带,并优化了诱导表达的较适温度、IPTG诱导浓度和诱导表达时间.故成功构建了p ET-32a-Os AAA1原核表达载体并获得了可溶性Os AAA1目的蛋白,为其后续研究奠定了基础.     

重组人血管内皮生长因子165在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化与体外活性评价

人血管内皮生长因子165(VEGF165)可有效促进血管新生和增加血管通透性,在伤口愈合方面有重要医疗价值。建立获取高纯度、高活性的优质重组VEGF165蛋白的方法具有重要意义。研究利用带有6组氨酸标签的二硫键形成蛋白A(Dsb A)的E.coli表达系统实现了Dsb A-VEGF165融合蛋白的可溶性表达;诱导过程中添加5%(v/v)的乙醇可显著提高工程菌中可溶性融合蛋白表达水平。融合蛋白通过Ni亲和层析粗纯,并经牛肠激酶酶切去除标签蛋白。随后利用肝素亲和层析精纯获得重组人VEGF165蛋白。非还原及还原SDS-PAGE电泳检测到分子量为约40 k Da的同源二聚体蛋白,促HUVEC细胞增殖实验显示重组蛋白具有较优的活性,EC50为13 ng/m L。研究实现了Dsb A-VEGF165的在E.coli中可溶性表达,建立了经济、高效的纯化方法,获得了高质量、高活性的重组人VEGF165蛋白。     

重组人瘦素蛋白的原核表达、纯化和生物学活性鉴定

为解决重组人瘦素蛋白(hLeptin)大规模生产过程中包涵体的形成以及体外重折叠过程中蛋白聚集导致的低产量,探究在大肠杆菌中hLeptin高水平可溶性的表达,并进行生物学活性检测.利用hLeptin成熟肽基因与pET-30a(+)-SUMO系统构建融合表达质粒pET-30a(+)-SUMO-Lep,转化至大肠杆菌BL21(DE3),加入异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)进行诱导表达,之后经Ni金属亲和层析纯化,并切去SUMO融合标签后获得成熟hLeptin.重组hLeptin表达量高,主要以可溶形式存在.通过KM小鼠减肥实验和CCK8实验证明重组hLeptin具有生物学活性.综上,使用SUMO融合标签,以增强hLeptin在大肠杆菌中的高效可溶性高纯度的表达,为大规模生产hLeptin提供了一种新方法,同时为表达可溶性重组蛋白研究提供了一定的基础.     

人泡沫病毒GAG、ENV蛋白的原核表达、抗血清制备及鉴定

构建了HFV的GAG和ENV蛋白原核表达载体pET-32a-gag和pET-32a-env,转化E.coli BL21Star(DE3)后用IPTG诱导出高水平的GAG、ENV融合蛋白表达.以融合蛋白免疫新西兰兔制备了GAG和ENV抗血清.Western Blot检测表明,抗血清可以识别原核表达的GAG和ENV蛋白,说明抗血清具有较好的特异性.结合Western Blot和间接免疫荧光实验,表明抗血清可以检测到病毒表达的GAG和ENV蛋白.     

hCuZn-SOD基因的克隆、表达及其产物的初步纯化和表征

为获得hCuZn-SOD基因,根据GenBank中人铜锌超氧化物歧化酶(hCuZn-SOD)基因碱基序列,设计扩增引物,用RT-PCR方法从人的肝细胞中克隆出hCuZn-SODcDNA序列,并将它插入pUCm-T载体中,经过DNA序列测定证实,该片段序列的一个碱基发生突变(与报道基因相比),引起其编码第116个氨基酸由G变为D.采用定向克隆的方法将hCu Zn-SOD的cDNA片段克隆到表达载体pGEX-2T上,构建表达质粒pGEX-SOD,并转化大肠杆菌BL21(DE3).SDS-PAGE分析证实,经IPTG诱导,融合蛋白GST-SOD获得高效表达.破碎菌体、上清经谷胱甘肽亲和层析初步纯化后,得到纯度达90%的目的蛋白.活性实验表明,GST-SOD具有生物活性.     

拟南芥AtERF1蛋白的原核可溶性表达及多克隆抗体的制备

转录因子AtERF1属于ERF/AP2家族的B3亚家族,参与植物的防卫反应.根据密码子简并原理,用基因全合成的方法合成了满足大肠杆菌密码子嗜好的编码拟南芥AtERF1蛋白的碱基序列,并将其克隆到原核表达载体pET-29b.将表达载体AtERF1-pET-29b转入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG成功诱导表达了分子量约30kD的AtERF1蛋白,该蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在.以该蛋白为抗原免疫家兔,制备出的多克隆抗体经免疫双扩散测定效价达1∶16,Western blot检测表明该抗血清与AtERF1蛋白识别良好.AtERF1抗体的制备为进一步从生化水平上研究AtERF1的功能奠定了良好基础.     

SpiC/SsaM蛋白质复合物的原核表达及纯化

沙门氏菌毒力岛2中spiC所编码的效应蛋白在沙门氏菌得以于宿主吞噬性细胞内的存活中起到重要作用．SpiC与位于相同操纵元的SsaM特异结合,暗示了SpiC／SsaM蛋白质复合物参与转运元的形成并调控其他效应蛋白的分泌．为了从蛋白质结构角度研究SpiC／SsaM复合物的生物学功能,原核体系中共表达了SpiC和SsaM．与SpiC形成稳定的复合物,改善了SsaM单独表达不可溶的情况．胰蛋白酶限制性酶切实验显示：相对单独存在于溶液中的SpiC,形成复合物的SpiC更加稳定．得到大量高纯度的胰蛋白酶处理后的SpiC／SsaM复合物,并进行了结晶试验,为后续结构学研究奠定了基础．     

豌豆胰岛素基因克隆、表达及融合蛋白纯化

将人工合成的豌豆胰岛素(PAlb)基因寡核苷酸片段,通过PCR扩增得到PA1b基因,将此基因克隆到原核表达载体pMAL-p2x中,然后将重组质粒pMA1-p2X-PA1b转化大肠杆菌DH5a,经IPTG诱导进行可溶性表达．以Amylose Resin亲和层析,纯化出融合蛋白MBP-PA1b．经SDS-PAGE及Western印迹证明,融合蛋白MBP-PA1b在大肠杆菌中表达成功,为深入研究PA1b的功能作了准备．     

带有TAT-PTD跨膜转导域融合基因的原核表达及表达条件优化

为构建pGEX-TAT-GFP原核表达质粒并优化GST-TAT-GFP表达条件,将PCR扩增的基因TAT-GFP克隆至质粒pGEX-2T,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达并优化表达条件,表达产物进行SDS-PAGE、Western blot及荧光学特性鉴定.结果表明:构建的质粒经PCR、酶切和DNA测序正确,含有重组质粒的宿主菌经过IPTG诱导表达分子量约为54.3 kD的融合蛋白GST-TAT-GFP,并经优化确定最佳的诱导表达条件.