VMP1基因的克隆及其抗体的制备与鉴定

为了得到效价高、特异性强、能用于检测内源性 VMP1 蛋白的抗体,采用RT-PCR 法,从L929细胞株中克隆鼠VMP1基因,重组入pCMV5载体,用 PCR 扩增与其氨基酸 132-239 区域对应的DNA片断,将该片段连接到原核表达载体 pGST parallel 中,在大肠杆菌 BL21 菌株中大量表达,经谷胱甘肽-琼脂糖树脂纯化后,得到高纯度的 VMP1抗原.免疫新西兰兔,获得抗 VMP1 蛋白的兔抗血清,将血清纯化后即得到抗 VMP1 的多克隆抗体.用 Western blot 分析手段检测了该抗体的特异性及效价.在用该抗体检测外源性和内源性 VMP1 蛋白的试验中,证实该抗体效价高,特异性强,效果很理想.此方法可用于获得大量廉价的抗 VMP1 蛋白的高滴度和高特异性的抗体,为进一步研究 VMP1 在细胞内,尤其是在信号转导通路中的功能和作用奠定了基础.     

抗人骨桥蛋白单克隆抗体制备及其特异性研究

利用RT-PCR技术克隆人骨桥蛋白(hOPN)基因,构建OPN原核表达质粒pET-32a(+)-hOPN,转化BL21菌株,经IPTG诱导表达重组人骨桥蛋白(rhOPN).以纯化的rhOPN为免疫原,免疫BABL/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞NS1融合.通过有限稀释法进行克隆和间接ELISA筛选,获得抗人OPN蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株,以ELISA、Western blot对抗体特异性进行鉴定.通过竞争抑制试验对单克隆抗体识别抗原位点进行分析.结果共获得2株抗人OPN单克隆抗体,分别命名为8F1和2B5,亚型测定皆为IgG1.通过细胞侵袭抑制试验检测,2株抗人OPN mAb皆能很好地抑制细胞迁移.本研究成功获得了抗人骨桥蛋白的特异性单克隆抗体,为进一步研究OPN蛋白在自身免疫病和肿瘤中的功能提供了重要的工具.     

VMP1基因的克隆及其抗体的制备与鉴定

为了得到效价高、特异性强、能用于检测内源性VMP1蛋白的抗体，采用RT-PCR法，从L929细胞株中克隆鼠VMP1基因，重组入pCMVS载体，用PCR扩增与其氨基酸132-239区域对应的DNA片断，将该片段连接到原核表达载体pGST parallel中，在大肠杆菌BL21菌株中大量表达，经谷胱甘肽-琼脂糖树脂纯化后，得到高纯度的VMP1抗原．免疫新西兰兔，获得抗VMP1蛋白的兔抗血清，将血清纯化后即得到抗VMP1的多克隆抗体．用Western blot分析手段检测了该抗体的特异性及效价．在用该抗体检测外源性和内源性VMP1蛋白的试验中，证实该抗体效价高，特异性强，效果很理想．此方法可用于获得大量廉价的抗VMP1蛋白的高滴度和高特异性的抗体，为进一步研究VMP1在细胞内，尤其是在信号转导通路中的功能和作用奠定了基础．     

兔抗PEB1多克隆抗体的制备及鉴定

摘要：【目的】利用纯化的空肠弯曲菌表面蛋白PEB1,制备其多克隆抗体。【方法】用PEB1蛋白作为抗原免疫兔,分离血清得到兔抗PEB1多克隆抗体,用ELISA法检测抗体效价,并用Western-Blotting验证。【结果】PEB1蛋白免疫兔后,得到了兔抗PEB1多克隆抗体,间接ELASA法检测表明兔抗PEB 1血清效价达到1：10 000,Western印记检测表明,该抗体能与PEB1蛋白发生特异性结合,其特异性与敏感性均较好。【结论】获得了高效价的PEB1多克隆抗体。     

人乳腺癌细胞（MCF—7）相关抗原超微结构的定位观察

本文以二种免疫电镜法对人乳腺癌细胞系—MCF-7细胞肿瘤相关抗原进行定位观察: 1.直接免疫铁蛋白法。采用戊二醛二步结合法制备铁蛋白偶联人乳腺癌单克隆抗体6C_6B_1B_7A_(12)结合物,并以直接法对MCF-7细胞进行包埋前免疫染色。 2.间接免疫酶标电镜法。以6C_6B_1B_7A_(12)单克隆抗体为第一抗体,过氧化物酶标记兔抗小鼠IgG抗体的结合物为第二抗体对MCF-7细胞进行包埋前免疫染色。 电镜观察结果表明,该肿瘤相关抗原仅分布于MCF-7细胞表面。抗原的存在可能与细胞周期或细胞群体的变异性有关。     

pEGX-4T-2/NAP1融合蛋白的原核表达及鉴定

以鼻咽组织cDNA为模板,PCR扩增NAP1基因编码区,PCR产物克隆入pUCm-T载体,筛选阳性克隆. 构建NAP1基因编码区的原核表达载体pEGX-4T-2/ NAP1,转化大肠杆菌BL21. 经IPTG诱导表达后,在不同时段收集菌体,提取细菌的全部蛋白. 经12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,发现细菌全蛋白中在35 KD～36 KD处多出一条明显条带. 用兔抗人NAP1多克隆抗体,利用Western Blotting对该融合蛋白的表达进行了鉴定,NAP1基因的融合蛋白表达成功,为制备NAP1单克隆抗体和获得有生物活性的NAP1蛋白,进一步研究NAP1蛋白的功能奠定了基础.     

Rab39A多克隆抗体的制备与鉴定

制备抗人Rab39A多克隆抗体并进行纯化检测,以用于Rab39A功能的研究.选取免疫原性强且特异性高的羧基端42个氨基酸(176～217aa)作为目的片段.PCR法扩增并构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Rab39C42.异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并纯化GST-Rab39C42融合蛋白,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体.然后以亲和层析法纯化抗体,利用Western blot和免疫荧光检测抗体的特异性.结果表明,构建的原核表达载体经IPTG诱导后高效表达GST-Rab39C42蛋白,纯化后抗体质量浓度为1μg/μL;Western blot实验显示,抗体可以识别外源Rab39A蛋白和多个细胞系的内源Rab39A蛋白;抗体中和实验和RNA干扰实验证明了该抗体具有特异性.本研究成功构建了pGEX-4T-1-Rab39C42原核表达载体,并制备了特异性的抗人Rab39A兔多克隆抗体,为进一步研究Rab39A的功能提供了有力的支持.     

抗人前列腺素D合成酶嵌合抗体基因的构建

采用RT-PCR技术,从1株稳定分泌抗人L-PGDS单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞中扩增抗体的可变区基因,得2个Vk和1个VH．序列经Igblast比对分析,其中1个VK为鼠骨髓瘤细胞系内固有的无功能基因;另-Vk和VH具备鼠抗体可变区特征,为抗体功能基因．经双酶切,将抗体可变区功能基因分别与表达载体pAG4622、pAH4604中的人IgG相应恒定区相连,构建成抗人L-PGDS的人-鼠嵌合抗体基因。     

免疫亲和层析法从兔杂交瘤培养上清液中纯化兔抗烟草花叶病毒的单克隆抗体

报道一种较为简易的免疫亲和层析技术,从兔杂交瘤培养上清中分离纯化单克隆抗体。先用过碘酸钠活化层析柱填料Sepharose4B,然后加入碱性碳酸钠缓冲液与羊抗兔IgG于4℃偶联过夜,冲洗后加硼氢化钠使偶联稳定,经1％BSA-PBS溶液封闭,冲洗后即得到免疫亲和层析柱。将兔抗烟草花叶病毒（TMV）杂交瘤细胞2E2和3C6的培养上清加入亲和柱中,37℃下吸附1h,冲洗后用pH3稀盐酸溶液洗脱,洗脱液用Tris溶液调至pH中性,供SDS-PAGE分析和Westernblot实验。洗脱液中存在分子量约为60000与52000的二条蛋白条带。Westernblot结果显示,纯化抗体对纯化TMV样品,以及TMV侵染的烟草病叶中的TMV都具有非常好的识别能力。利用所报道的免疫亲和层析技术,从兔杂交瘤培养上清中成功分离纯化到兔抗TMV的单克隆抗体。     

GFAP单克隆抗体制备及ELISA检测方法研究

制备抗胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)单克隆抗体,并尝试建立双抗夹心ELISA检测方法,为出血性脑卒中早期诊断提供基础材料.用重组人GFAP作为抗原免疫BALB/C小鼠,通过杂交瘤技术制备抗GFAP单克隆抗体;用HRP标记单克隆抗体,ELISA和Western blot检测抗体的亚类、表位和特异性;采用ELISA技术制备GFAP检测试剂盒.获得了7株抗GFAP单克隆抗体,抗体亚类为Ig G2或Ig G1,抗体特异性好.抗体配对成功,ELISA检测重组人GFAP灵敏且稳定.     

抗人FXYD6单克隆抗体的制备及鉴定

制备了抗人FXYD6单克隆抗体,并进行初步鉴定.以FXYD6合成多肽作为免疫原,利用单克隆抗体杂交瘤技术建立阳性克隆细胞株;腹水诱导法制备抗人FXYD6单克隆抗体;蛋白A亲合层析法纯化;ELISA测定FXYD6单克隆抗体的特异性和效价;以所得特异性抗体为一抗,利用免疫组化法检测胰腺癌组织中FXYD6的表达.结果成功获得1株稳定分泌特异性抗人FXYD6单克隆抗体的杂交瘤细胞株;腹水诱导法生产抗人FXYD6单克隆抗体2.86 mg;FXYD6单克隆抗体可以与FXYD6合成多肽特异性结合,抗体效价1:5400;免疫组织化学显示胰腺癌组织中胞膜呈阳性染色.成功获得FXYD6单克隆抗体可以为进一步研究FXYD6的组织分布、生物学作用创造条件.     

DSCR1抗体制备与应用

本实验利用Fmoc固相多肽合成的方法合成DSCRI氨基端一个多肽片段(55-70AA),经HPLC纯化后偶联到匙孔槭血蓝蛋白,免疫新西兰雄兔后采血检测、纯化、经Westem blotting、免疫沉淀证实得到的抗体为抗DSCR1的特异抗体。谊抗体即能检测人源DSCR1蛋白,又能检测小鼠的DSCR1蛋白。运用获得的DSCR1多克隆抗体进行功能研究。发现DSCR1广泛存在泛素化,参与泛素化-蛋白酶体途径。     

58型人乳头瘤病毒E7蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

 为获得抗58型人乳头瘤病毒(HPV58)E7蛋白的单克隆抗体,乳糖诱导重组工程菌表达HPV58 E7融合蛋白,以纯化后的该重组蛋白为免疫原,经细胞融合和有限稀释后,得到6株分泌抗HPV58 E7单克隆抗体(McAb)的工程细胞株,并采用体内接种方法及亲和柱层析纯化技术制备6株抗体.酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western-blot实验和细胞免疫荧光检测结果表明,所得抗体均为IgG2a类,κ型,抗体效价均可达10^-5,并且能够与原核及真核系统表达的HPV58 E7蛋白发生特异性抗原-抗体反应.该抗体的成功制备为后续HPV58 E7致癌生物学研究及相关肿瘤诊断试剂的开发奠定基础.     

人绒毛膜促性腺激素β亚基(hCG-β)单克隆抗体的制备及鉴定

为了获得抗人绒毛膜促性腺激素β亚基(hCG-β)单克隆抗体,以hCG为免疫原,经细胞融合和有限稀释后,得到4株分泌抗hCG-β单克隆抗体(McAb)细胞株.酶联免疫吸附测定(ELISA)结果表明,所得抗体均为IgG1,κ型,其腹水效价均可达10-6.     

GGPPS多克隆抗体的制备与鉴定

构建人香叶基香叶基二磷酸合成酶基因(GGPPS)原核表达载体,制备兔抗人GGPPS多克隆抗体.利用DNA重组技术构建原核表达载体pGEX-4T-GGPPS,诱导表达GGPPS融合蛋白,分离纯化该融合蛋白后,作为免疫原免疫家兔制备多克隆抗体.成功构建了pGEX-4T-1-GGPPS原核表达载体,转化Rosetta菌株后可高效表达GGPPS融合蛋白,成功制备GGPPS多克隆抗体,间接ELISA法测定抗体效价为1∶32000,并且抗体具有良好特异性.成功克隆GGPPS基因并制备了特异性的兔抗人GGPPS多克隆抗体,为进一步研究GGPPS的功能奠定了基础.     

人骨保护素N端片段在大肠杆菌中的表达及其活性分析

OPG成熟肽N端D1～D4结构域仅由2个外显子编码.以人基因组DNA作为模板,PCR分别扩增骨保护素基因外显子2和外显子3,再以2种PCR产物的混合物作为模板,采用重组PCR法得到N端D1～D4域编码序列,使该序列与载体pET42a部分序列相连,然后克隆人载体pET42a进行表达,SDS-PAGE表明产物主要以包涵体形式存在,可被抗OPG多克隆抗体识别.Glutathione Sepharose4B亲和层析纯化融合蛋白GST-hOPG(D1-4),Xa切割祛除担体蛋白及进一步分离纯化.采用破骨细胞样细胞诱导分化实验来检测重组蛋白的生物活性,证实该重组蛋白可以抑制OLC的生成.     

烟草花叶病毒单克隆抗体的制备和鉴定

经工程菌表达与纯化,得到了纯度95%以上的TMV-CP-F重组蛋白,配合提取的TMV天然病毒颗粒作为免疫原.通过杂交瘤技术获得了14株能分泌特异针对TMV外壳蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株.经鉴定14株细胞所分泌的抗体亚类为IgG1型,抗体轻链均为κ型.经ProteinA一步法亲和层析纯化所得抗体经鉴定相对分子质量在149.36～157.23 ku之间,抗体纯度在80%以上.经间接ELISA测定,14株抗体均与TMV-CP重组蛋白和TMV病毒有良好特异性反应.所制备的抗TMV抗体的特异性高,可用于与其相关的免疫检测研究和应用.     

人白血病抑制因子（hLIF）单克隆抗体的制备与鉴定

 为了获得抗人白血病抑制因子（hLIF）单克隆抗体,以重组hLIF蛋白为抗原,免疫Balb/c小鼠,采用传统的小细胞融合、无限稀释法制备了10株杂交瘤的腹水hLIF抗体,并对腹水进行了纯化.腹水粗品抗体经rProteinA一步亲和层析法纯化和鉴定后,抗体分子量都符合抗体的特性,抗体的纯度都达到了96.6%以上,抗体亲和常数在1.89×10-9~1.51×10-12mol/L,其中1B8a、5C1b、5G4a细胞株制备的抗体属于高亲和力抗体,可以对其的应用进行进一步的研究和探讨.     

心肌肌钙蛋白I-C复合物酶联免疫检测方法的建立

为了制备抗人心肌肌钙蛋白I(cTnI)单克隆抗体、建立检测人cTnI链酶亲和素-生物素双抗体夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)方法,用基因工程表达的人cTnI免疫雌性BALB/c小鼠,以杂交瘤技术制备得到三株特异性抗人cTnI的单克隆抗体记为6G3,6A6,3G9.三株杂交瘤细胞中6G3和6A6为IgG1,3G9为IgG2b,腹水效价分别为4×10-5,4×10-5和10-5.亲和常数为5.0×109,6.4×109和3.8×109mol-1.Westernblotting结果表明6G3和6A6能够识别cTnI-C复合物.把6G3抗体生物素化并制备抗cTnI、cTnC和cTnI-C的大鼠多克隆抗体.以多抗作为固相捕捉抗体,生物素化6G3抗体作为检测抗体,建立检测cTnI的双抗体夹心ELISA方法并初步应用于临床病人标本检测.以cTnI-C复合物多抗捕捉检测方法具有良好的灵敏度、特异性和准确性,灵敏度为0.9ng/mL,较包被其他抗体捕捉方法提高1~2倍.批内变异系数为5.03%,回收率为94.56%.测定17例AMI病人和18例血清样本临床诊断结果符合率为100%.