alc基因开关系统在水稻中的建立和优化

对以构巢曲霉的alc调控元件为基础构建的酒精诱导系统（alc系统）可在转基因水稻中调控GUS编码基因的表达进行了详细研究。结果表明。在转基因水稻中，非诱导状态下alc系统控制下的报告基因没有表达；通过根部浇灌方式施加酒精后则可诱导报告基因的表达,alc系统的表达活性依赖于酒精浓度：0.1%的酒精不能诱导alc系统，而0.5%的酒精可使GUS活性提高大约70倍。2%的酒精浓度下alc系统的表达活性最高，是诱导前的120倍左右；并且这些浓度的酒精对水稻均未观察到生理毒害作用。酶动力学研究表明，诱导48h后，GUS编码基因开始表达；96h后，GUS活性达到最高，可达诱导前的130倍左右。120h后GUS活性开始降低，对诱导前后的叶片进行组织化学染色检测，结果也证实alc系统可以严谨地控制外源基因在水稻中的表达。     

人神经生长因子β亚基的基因在P.pastoris和E.coli中的表达

将hNGFB基因插入甲醇营养性酵母P .pastoris分泌表达载体pHIL S1和E .coli表达载体pET 15b中 ,相应转化P .pastorisGS115 (Mut+,His- )和E .coliBL2 1(DE3 ) .在不含组氨酸平板上生长的酵母转化子通过PCR进一步筛选阳性克隆 ,P .pastoris重组菌株的蛋白电泳表明发酵液中有特异表达带 ,扫描分析占细胞外泌总蛋白的 14 .4% ,Westernblotting证实该分泌蛋白具有hNGF的免疫活性 .E .coli重组菌株在IPTG的诱导下表达融合蛋白 .电泳扫描分析表达的融合蛋白占细胞总蛋白量的 10 .3 % ,Westernblotting检测表明具有免疫活性 .     

质子跨膜转运能够引起艾氏腹水癌细胞质膜表面局部脱水

我们实验室曾经发现多种质子泵活性能够引起生物膜和脂质体膜的融合,并发现琥珀酸氧化启动的线粒体呼吸链质子泵活性能够使线粒体外膜表面pH值降低0.6,在此基础上提出了质子泵诱导膜融合的理论模型.认为质子泵诱导膜融合的分子机制在于使生物膜表面质子化,引起膜表面水化层中水分子与磷脂极性端之间氢键结合的断裂,导致瞬间的和局部的脱水,从而引起两个相对膜间的接触和融合.近来,我们实验室在小鼠艾氏腹水癌细胞质膜     

重组蓝细菌PsbF亚基形成β:β同源二聚体细胞色素b-559

所有进行放氧光合作用的生物都具有两个光系统-- 光系统Ⅰ和光系统Ⅱ. 目前所分离到的最小的有光化学活性的光系统Ⅱ含3个亚基: D1, D2和细胞色素b-559. 细胞色素b-559在光系统Ⅱ中的作用至今不明. 利用基因重组方法, 将Synechococcus sp PCC7002的psbF基因以融合基因形式在大肠杆菌中高效表达, 获得有氧化还原活性的细胞色素b-559. 用凝血酶处理除去N末端谷胱甘肽氧化还原酶后获得的PsbF亚基仍有氧化还原活性, 说明PsbF可在大肠杆菌中形成二聚体. 不论是融合蛋白还是PsbF二聚体, 其氧化态吸收光谱、还原态吸收光谱和二者的差示光谱同分离到的高等植物细胞色素b-559光谱相同. 氧化还原滴定显示,二者的氧化还原电位在50 mV左右. 上述结果对确定细胞色素b-559的亚基组成和蛋白在膜上的定位有很大帮助.     

斯氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri A1501氧胁迫下基因表达谱研究

斯氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri A1501分离自我国南方水稻田, 在低铵和微好氧条件下能紧密结合在水稻根表, 并侵入根内生长和固氮. 为探讨氧对A1501基因组表达的影响, 利用全基因组芯片技术, 研究不同氧浓度(0.5%, 21%)下A1501基因组表达谱, 结果表明: (ⅰ) 67个基因在高氧浓度下表达上调2倍以上, 其中17个基因的功能未知; (ⅱ) 68个基因在高氧条件下表达, 其中约50%的基因参与固氮或反硝化. 实时定量RT-PCR验证结果表明, 4个编码氧化还原酶的基因和7个编码胞外夹膜多糖和抗原寡糖合成的基因在高氧下表达上调, 其中sodC在高氧下表达上调2.7倍、编码黄素单胺氧化酶相关蛋白的基因PST1610表达上调2.2倍、编码α-酮戊二酸-铁氧化酶族氧化还原酶的基因PST3584表达上调3.2倍、编码NAD依赖型氧化还原酶的基因PST2179表达上调2.9倍. 这些基因及其表达产物可能在A1501氧保护机制中发挥作用.     

重组蓝细菌PsbF亚基形成 β∶β 同源二聚体细胞色素b-559

所有进行放氧光合作用的生物都具有两个光系统—— 光系统Ⅰ和光系统Ⅱ. 目前所分离到的最小的有光化学活性的光系统Ⅱ含3个亚基: D1, D2和细胞色素b-559. 细胞色素b-559在光系统Ⅱ中的作用至今不明. 利用基因重组方法, 将Synechococcus sp PCC7002的psbF基因以融合基因形式在大肠杆菌中高效表达, 获得有氧化还原活性的细胞色素b-559. 用凝血酶处理除去N末端谷胱甘肽氧化还原酶后获得的PsbF亚基仍有氧化还原活性, 说明PsbF可在大肠杆菌中形成二聚体. 不论是融合蛋白还是PsbF二聚体, 其氧化态吸收光谱、还原态吸收光谱和二者的差示光谱同分离到的高等植物细胞色素b-559光谱相同. 氧化还原滴定显示, 二者的氧化还原电位在50 mV左右. 上述结果对确定细胞色素b-559的亚基组成和蛋白在膜上的定位有很大帮助.     

磷脂酰甘油对缺钙光系统Ⅱ放氧活性的影响

磷脂酰甘油对缺钙光系统Ⅱ的放氧活性具有显著的影响,即ＰＧ可以Ⅱ颗粒因缺钙而受抑制的放氧活性得到恢复。外加Ｃａ＾２＋可使表现出对ｄＣａＰＳⅡ放氧活性的更大促进作用,阻随Ｃａ＾２＋浓度的增加,促进作用也越显著。     

泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡萄糖淀粉酶基因克隆及在酒精酵母中的表达与分泌

泡盛曲霉(Aspergillus awamori)产生的葡萄糖淀粉酶是一种诱导的糖蛋白,它具α-1,4和α-1,6-D-glucan glucohydrolase活性,广泛用于需糖化淀粉的工艺.若将该酶基因导入啤酒酵母,构建能直接利用淀粉的酵母工程菌株,可省去淀粉液化和糖化的过程.国际上已有将泡盛曲霉的葡萄糖淀粉酶导入啤酒酵母的报道.该酶作用最适温度为60℃,对食用乙醇生产工艺较为有利.因此,我们用RT-PCR技术克隆了泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶Ⅰ基因,将其置于酵母烯酸酶(Enolase)启动子(Promotor)和终止子(Terminator)之间,构建了表达载体,转化非营养缺陷型酒精酵母AS.2.1364,获得能将淀粉转化为葡萄糖并可发酵产生酒精的转基因酵母菌株.1 材料与方法(1)菌种及培养基 泡盛曲霉(Aspeergillus awamori)NMRL3112,葡萄糖淀粉酶Ⅰ基因供体,采用文献的培养基;酒精酵母(Sacchromyces cerevisiae)AS.2.1364为葡萄糖淀粉酶基因受体,采用YPD培养基;转化酵母采用YPDS培养基,含1%葡萄糖和1%可溶性淀粉.大肠杆菌TG1作为pAC1(由刘宏迪保存)及测序质粒pGEM-3zf( )的宿主菌,采用LB培养基,氨卞青霉素抗性.     

离子束介导转基因提高E.coli UV敏感菌株的DNA损伤修复能力

以氯化钙制备感受态受体细胞转移法为对照,用离子束介导基因转移技术,将具有高效ＤＮＡ损伤修复系统的耐辐射异常球菌（Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ ＡＳ１．６３３）的基因组ＤＮＡ片段,转入对紫外（ＵＶ）辐照敏感的大肠杆菌中。结果表明,转入ＤＮＡ后的菌株对ＵＶ辐射的抗性不仅高于其对应的敏感菌株,而且也高于其对应的敏感菌株的产生菌株,表现为转入ＤＮＡ后的菌株受紫外辐照的存活率明显提高,代表修复合成的非按期ＤＮ     

苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)中两个gcvA基因的鉴定及其特性

GcvA蛋白是LysR转录因子家族成员, 在大肠杆菌(Escherichia coli)中, 它激活编码裂解甘氨酸酶系(GCV)操纵子(gcvTHP)的表达, 这一过程受甘氨酸诱导. 在以前的工作中, 我们分别突变了苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)中90个LysR家族转录因子, 并鉴定了突变株的表型. 本研究证明了苜蓿中华根瘤菌基因组中存在2个gcvA基因gcvA1和gcvA2; 苜蓿中华根瘤菌gcvTHP操纵子的充分激活需要它们的同时存在. gcvA1对gcvTHP操纵子的激活需要甘氨酸诱导, 而gcvA2对gcvTHP操纵子的激活则不需要甘氨酸诱导, 推测苜蓿中华根瘤菌中gcvTHP表达的调控机制与大肠杆菌中的不同. 进化分析显示, 很多原细菌中都存在GcvA蛋白, 而苜蓿中华根瘤菌的GcvA1和GcvA2与大肠杆菌的GcvA的亲缘关系很远, 这也许可以解释它们gcvTHP表达调控模式的不同. 研究结果为LysR基因家族的功能提供了新的线索.     

小鼠眼角膜上皮细胞中IL-1Β对Fas配体的表达调控研究

Fas配体(Fas Ligand, FasL)在多种不同的上皮细胞中均见表达, 在炎症反应中诱导Fas阳性免疫细胞凋亡以保护组织. 为了研究眼角膜炎症反应过程与Fas配体之间的关系, 本研究检测了在眼角膜上皮细胞中IL-1β对FasL的表达翻译水平以及细胞毒性的影响, 明确了在眼角膜上皮细胞中IL-1β抑制FasL的表达以及蛋白翻译, FasL的启动子活性受到IL-1β作用浓度的影响, 两者呈相关性表现, 发现IL-1β阻断由FasL诱导Fas阳性细胞对于眼角膜上皮细胞的细胞毒性作用. 这些结果表明, 眼角膜上皮细胞FasL受IL-1β的调控.     

水稻Bowman-Birk蛋白酶抑制剂基因OsWIP1-2的诱导表达及其抑制活性

克隆了水稻的WIP1基因, 该基因属于Bowman-Birk蛋白酶抑制剂(BBI)家族. RNA杂交实验结果显示该基因的表达受伤害和茉莉酮酸的诱导, 表明它在植物防御反应中起着重要的作用. 将此基因克隆到表达载体pET28a, 并在大肠杆菌中表达融合蛋白. 分别用胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶为底物检测纯化的融合蛋白的抑制活性, 发现融合蛋白具有胰凝乳蛋白酶的抑制活性, 但没有对胰蛋白酶的抑制活性; 同时发现融合蛋白C端的融合残基对蛋白酶抑制活性有重大影响, 具有C端(His)₆纯化标签的融合蛋白不具有胰凝乳蛋白酶的抑制活性, 而有天然C端序列的融合蛋白具有胰凝乳蛋白酶的抑制活性, 这暗示了过长的C末端序列可能会影响WIP1蛋白的正确折叠. 蛋白酶抑制活性分析表明水稻Bowman-Birk抑制剂家族的成员可能在结构和功能上均发生了分化.     

紫云英根瘤菌自生培养物的氢酶表达与固氮

根瘤菌吸氢酶引人注目的方面在于减少宿主植物的能量损失。尽管吸氢正反应(Hup~+)与吸氢负反应(Hup~-)菌株的比较回接试验在大豆、豌豆和豌豆类宿主植物上表明,植物干重和植物含氮量的提高与Hup~+之间尚无稳定的正相关性,但是,就植物光合产物的利用而言,与Hup~-比较,Hup~+的豌豆根瘤菌菌株显示出经济优势。氢吸收系统的效益在紫云英上也有所体现。前文,我们报道高活性的固氮酶与氢酶可在紫云英根瘤内协同形成,利用外源分子氢可提高根瘤的共生固氮活性。本文继续在自生条件下证明氢吸收活性与固氮酶的共轭表达,并表明固氮活性受氢吸收系统支持。     

金属络合剂对玉米线粒体抗氰化物氧化的影响

在前文中曾报道,玉米黄化幼苗线粒体具有一条抗氰化物的呼吸途径.对氰化物的敏感性与氧化底物有关,琥珀酸氧化对氰化物的敏感性远大于通过NAD-连接脱氢酶的底物氧化.例如,在含有1m M KCN介质中,玉米线粒体的末端氧化酶活性或琥珀酸的氧化虽已全部受到抑制,但α-酮戊二酸的氧化仍然没有明显影响.只有同时加入KCN和KSCN,它的氧     

人硫氧还蛋白存在不同的选择性剪切形式

利用RT_PCR技术、基因克隆化和基因表达技术 ,首次在人胎肝细胞中发现了人硫氧还蛋白 (hTRX)的另外一种选择性剪切形式 (hTRXδ3) .经测序证实hTRXδ3缺失正常hTRX第 3外显子的 6 0bp ,无其他编码区域改变 ,其酶活性位点依然存在 .经大肠杆菌表达重组蛋白的活性分析 ,hTRXδ3依赖DTT催化胰岛素还原的活性明显低于完整的hTRX蛋白 .本文结果为进一步研究hTRX的结构与功能提供了基础     

sTRAIL在大肠杆菌中的表达及其诱导细胞凋亡活性的研究

TRAIL(TNF relatedapoptosis inducingligand ,简称TRAIL或Apo 2L)是肿瘤坏死因子家族的新成员 ,体外研究表明其具有特异性杀伤肿瘤细胞的功能 .为了进一步探索TRAIL的生物学功能及其临床应用前景 ,首次从中国正常人外周血淋巴细胞中扩增了TRAIL胞外功能区(sTRAIL) ,并将其插入原核表达载体 ,转化大肠杆菌后 ,可溶型重组蛋白 (rsTRAIL)获得了高效稳定表达 ,其产量达到菌体总蛋白的 30 %左右 .体外研究表明 ,亲和层析纯化后的重组蛋白在 0 .1～ 1 μg/mL的浓度范围内 ,能显著诱导所试全部 7种肿瘤细胞株细胞凋亡 ,但不能诱导正常鼠成纤维细胞株细胞凋亡 ;进一步研究表明 ,rsTRAIL对贲门癌、乳腺癌和恶性胸腺瘤等原代细胞也具有强烈的杀伤作用 ,但不能杀伤正常人外周血淋巴细胞 .此实验结果为rsTRAIL特异性地诱导肿瘤细胞凋亡的生物学作用提供了新的实验证据 ,具有重要的临床应用价值 .     

存在水稻中新型农杆菌毒性区基因的信号分子

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒毒性区基因所编码的特殊的接合系统将介导T-DNA由农杆菌向高等植物的运动和转移.在双子叶植物中,该系统可通过二元调节系统被许多植物酚类激活.然而,对单子叶植物,尤其是禾本科作物而言,有关毒性区基因诱导因子的报道甚少.我们曾采用带有vir::lacZ融合基因的农杆菌系列菌株,研究了水稻不同组织、不同发育时期的渗出液及提取液对农杆菌毒性区基因的激活作用,发现只有在幼穗分化期至抽穗扬花期的叶片才能检测到较强的诱导活性.我们纯化了水稻中的毒性区诱导信号分子(RVS),其中一个为3,5-二羟-3’,4’-亚甲二氧基-5’-亚甲二氧基-5’-甲氧基-β-羰基二氢查耳酮(C_(17)H_(14)O_7).RVS的诱导方式与乙酰丁香酮(AS)相似,均随诱导物浓度和时间变化而变化.结果表明:在水稻中存在着毒性区基因诱导的信号分子,但只有在特定组织及特定发育时期才可被明显检测到.     

猪鼻支原体蛋白P37诱导人外周血单核细胞释放肿瘤坏死因子

胃癌组织中存在较高的猪鼻支原体感染率, 提示猪鼻支原体感染同胃癌的发生可能存在某种相关性. 由于肿瘤坏死因子(TNF-α)在微生物感染导致肿瘤发生中起重要作用, 而P37蛋白是猪鼻支原体的主要免疫原, 因此, 探讨P37能否诱导TNF-α的表达与释放, 对阐明猪鼻支原体在胃癌发生中的可能分子机制有重要意义. 运用PCR技术克隆了p37基因, 在对其编码序列中7个色氨酸密码子TGA进行TGG定点突变后, 利用PGEX-4T-1表达载体在大肠杆菌中成功表达了P37蛋白, 并经Western blot得到证实. 在此基础上, 利用RT-PCR及TNF-α敏感细胞株L929的细胞毒性实验, 发现P37确能诱导外周血单核细胞表达和释放TNF-α, 抗P37单克隆抗体PD4对该诱导活性有明显的中和作用. 结果提示, 猪鼻支原体通过P37诱导TNF-α产生在猪鼻支原体感染所致相关疾病中可能起重要作用, 值得进一步研究.     

泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡萄糖淀粉酶基因克隆及在酒精酵母中的表达与分泌

<正>泡盛曲霉(Aspergillus awamori)产生的葡萄糖淀粉酶是一种诱导的糖蛋白,它具α-1,4和α-1,6-D-glucan glucohydrolase活性,广泛用于需糖化淀粉的工艺.若将该酶基因导入啤酒酵母,构建能直接利用淀粉的酵母工程菌株,可省去淀粉液化和糖化的过程.国际上已有将泡盛曲霉的葡萄糖淀粉酶导入啤酒酵母的报道.该酶作用最适温度为60℃,对食用乙醇生产工艺较为有利.因此,我们用RT-PCR技术克隆了泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶Ⅰ基因,将其置于酵母烯酸酶(Enolase)启动子(Promotor)和终止子(Terminator)之间,构建了表达载体,转化非营养缺陷型酒精酵母AS.2.1364,获得能将淀粉转化为葡萄糖并可发酵产生酒精的转基因酵母菌株.     

经ibeB基因转染的鼠胚胎干细胞分化的研究

ibeB是一个致脑膜炎大肠杆菌K1株中参与大肠杆菌侵袭人脑微血管内皮细胞的基因. 以ibeB基因转染鼠胚胎干细胞, 结果表明, 大肠杆菌脑微血管内皮细胞侵袭蛋白IbeB不但具有“侵袭”功能, 而且可诱导真核细胞向神经样细胞分化, 经ibeB基因稳定转染的鼠胚胎干细胞能特异性表达神经前体细胞标志分子——nestin. GFP标记的活细胞观察显示外源性IbeB蛋白定位于细胞核. 上述结果提示ibeB基因可能在调控nestin表达过程中发挥功能, 这为研究nestin基因的表达调控提供了资料.