人源化IGF-Ⅰ基因的人工合成、重组与表达

为了实现人源化胰岛素样生长因子Ⅰ(human insulin-like growth factors-Ⅰ,hIGF-Ⅰ)基因在大肠杆菌中的高效表达,了解IGF-Ⅰ基因结构与功能的关系,探索人工制备的hIGF-Ⅰ在临床治疗疾病上的应用,实验参照GenBank中人IGF-Ⅰ氨基酸序列并进行密码子优化,然后人工合成这条基因并将克隆至pUC57载体上.构建重组表达载体pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ,转化大肠杆菌BL21菌株,进行不同诱导条件的优化,SDS-PAGE电泳确定最佳诱导条件,并利用建立hIGF-Ⅰ的间接ELISA检测方法分析表达产物活性.结果表明,获得重组表达载体pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ,并在大肠杆菌中实现与GST蛋白的融合可溶性表达.最佳诱导条件OD600值为0.8、IPTG浓度为0.5 mmol/L,表达蛋白的浓度为2.811 mg/mL,且产物具有抗原活性.说明人工制备的hIGF-Ⅰ与天然的hIGF-Ⅰ生物活性有部分相同,在基础研究和药物开发方面可作为替代物进行研究.     

重组人尿激酶原基因的克隆及工程菌的构建与鉴定

利用RT－PCR技术,从人脐带静脉上皮细胞中克隆重组人尿激酶原基因,用表达质粒pET29a构建了重组质粒pET29a/prouk,并转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,作为工程菌。经IPTG诱导表达,在46kDa处有一明显表达条带,表达量为约占菌体总蛋白的20％。该菌种在贮存与复苏及传代过程中具有良好的质粒稳定性和表达稳定性。     

用合成多肽免疫制备抗人心肌肌钙蛋白Ⅰ单克隆抗体的研究

介绍一种用合成的多抗原肽免疫动物来制备与天然人心肌肌钙蛋白Ⅰ特异反应的单克隆抗体新方法。从人心肌肌钙蛋白ⅠＮ端，根据多肽分子氨基酸的亲水性值选出了ＰＡＰＡＰＩＡＡＡＳＳ１１个氨基酸片段。将它用有八位点的赖氨酸核连接成多抗原肽后，以它为抗原用Ｒｉｂｉ佐剂进行免疫。将小鼠脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合，获１１株抗此多肽的杂交瘤细胞株。对其中７株属于ＩｇＧ亚类的细胞进行了ＥＬＩＳＡ分析，发现这７株细胞均与天然的人心肌肌钙蛋白Ⅰ呈特异性反应，而不与人骨骼肌肌钙蛋白Ⅰ发生交叉反应。利用３Ａ２细胞株所分泌的单克隆抗体对急性心肌梗塞患者、手术患者和正常人的血样进行了ＥＬＩＳＡ检测，证明它只对心肌梗塞患者血清发生阳性反应。获得了较为满意的结果。此细胞株所分泌的抗体有望用于心肌梗塞临床检测。     

人白细胞介素Ⅰ受体拮抗剂工程菌表达

人白细胞介素Ⅰ受体拮抗剂（IL－1ra)工程菌株表达目的蛋白水平受菌体生物量和诱导时间的影响,在生物量A60010 0．15－0．30温度热诱导3h-4h,目的蛋白表达量可达到较高水平。工程菌培养50代以上重组质粒保留90％以上。     

人心肌肌钙蛋白I和C亚基的基因工程表达及两者的结合实验

心肌肌钙蛋白I(cTnI)是检测心肌损伤的理想标志物,具有很高的特异性,在病人体内可停留较长时间．以人心肌cDNA为模板,通过PCR方法克隆了人的cTnI和cTnC基因,将cTnI和cTnC基因插入到原核表达载体pBV220中,转化E．coli DH5α菌株并诱导表达,经SDS-PAGE分析,分别发现分子质量为28ku和18ku的特异性蛋白条带．cTnI经Western blotting检测,结果与天然蛋白一致．将纯化得到的cTnI免疫小鼠后,用人天然标准抗原检测小鼠的抗血清效价在1：16000以上,并且呈高度特异性,与cTnC无交叉反应．而表达的cTnC可以在一定条件下和cTnI结合,证明2种基因工程蛋白是具有天然构象和结合功能的．cTnI和cTnC的表达及2种蛋白结合试验的研究结果为进一步研发免疫诊断试剂奠定了良好的基础．     

心肌肌钙蛋白Ⅰ在心血管疾病诊断中的应用

心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)为近年发展起来的心肌组织所特有的酶学标志物.由于cTnI的结构和组织特异性,使其在诊断心肌损伤时具有高度敏感性及特异性,并且明显优于心肌酶谱分析,具有广阔的应用前景.因此对cTnI的生化特性、检测方法及临床意义作一概述.     

重组人尿激酶原的工业化制备与性质研究

将含有 pET2 9a prouk重组质粒的人尿激酶原工程菌经 10L种子罐培养及 10 0L发酵 ,IPTG诱导表达 ,其表达量为占菌体总蛋白的 2 0 % ,表达产物经体外变复性 ,CM 纤维素离子交换层析 ,Superdex 75分子筛层析及Affi preppolymyxinsupport亲和层析去热源 ,每 10 0L发酵液得重组人尿激酶原纯品 6g ,纯度达 95 %以上 ,比活大于 1.2× 10 4 IU /mg ,双链含量低于0 .5 % ,内毒素及热源含量、宿主蛋白残留量、宿主DNA残留量等均达到临床使用标准 .其分子量 (质谱测定 )、氨基酸组成、N、C 端氨基酸序列分析等均与理论值相符 .进行了等电点及肽图等性质研究     

人载脂蛋白基因αpoAⅠ在毕赤氏酵母中的胞内表达

将PCR扩增得到的αpoAⅠ基因片段插入胞内表达质粒pPIC3．5K，重组的pPIC3．5K-αpoAⅠ用BglⅡ酶切后，转化Pichia pastoris GS115菌株，筛选获得G418高抗性转化子，再通过PCR鉴定证实口αpoAⅠ基因已整合到染色体上．其转化子经摇瓶发酵和甲醇诱导，收集细胞裂解后，用SDS-PAGE与Western blotting检测，证明胞内有明显的rApoAⅠ表达，其分子质量与人血浆提取的ApoAⅠ相同．     

基因重组酵母工程菌优化表达人源胶原蛋白

通过响应曲面法(RSM)优化巴氏毕赤酵母基因工程菌GS115/pPIC9KG6表达高亲水性重组人源胶原蛋白的摇瓶培养条件。采用Box-Behnken设计(BBD)考察初始诱导pH值、温度和甲醇添加量三个主要影响因子对重组人源胶原蛋白表达量的影响,利用DX7Trial软件设计实验方案,根据该方案设置不同培养条件进行实验并测定相关参数。响应面分析确定的最优因素水平组合为:初始诱导pH值为5.0,诱导温度为28℃,甲醇添加量为2.2%/24 h。通过响应面法优化发酵的内在因素水平,找出最佳条件,为利用其指导在发酵罐中进行高密度发酵生产人源胶原蛋白奠定基础。     

大强度运动对心肌肌钙蛋白Ⅰ及其降解酶μCalpain的影响

目的:观察急性、慢性大强度运动对血清心肌肌钙蛋白I及其降解酶μCaplpain的影响.方法:慢性运动组大鼠每天进行120min负重8%的游泳训练,每周6d共6周,第6周末进行一次性负重8%的力竭运动,急性运动组饲养到第6周末进行一次性负重8%的力竭运动,安静组常规饲养.各组均24h后取材,检测血清cTnI和心肌组织SOD、CAT活性、MDA含量和μCalpain mRNA表达.结果:急、慢性大强度运动后血清cTnI浓度显著上升,伴随μCalpain mRNA表达增加(P＜0.001),血清cTnI与μCalpain存在显著相关性(P＜0.001),但两个运动组之间血清cTnI水平、μCalpain mRNA表达没有显著差异,血清cTnI与抗氧化酶SOD活性呈显著负相关性.血清cTnI与MDA含量呈正相关,存在显著相关性(P＜0.05).结论:大强度运动可以导致cTnI降解、抗氧化酶活性下降和过氧化物堆积.大强度运动引起氧化应激反应和μCalpain mRNA表达增加,可能是激活μCalpain引起cTnI降解的原因.     

含副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)FlaI基因真核表达重组质粒的构建

用ClaI／EcoRI双切酶切带有副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus)极鞭毛蛋白FlaI基因的质粒p MD18-FlaI，回收目的基因片段，插和到真核细胞表达载体pIRESneo同样经ClaI/EcoRI切开的窗口中，成功地将FlaI克隆到pIRESneo中，获得有意义的重组质粒pIREneo－FlaI,构建的pIREneo－FlaI真核表达重组质粒，将为海水经济鱼类的副溶血弧菌DNA疫苗的研制奠定基础。     

基因工程菌Pichia pastoris高密度发酵表达重组人血清白蛋白

在摇瓶条件下对基因工程菌Pichia pastoris的发酵条件进行了实验，并根据摇瓶发酵的优化结果进行了补料分批高密度发酵。在分批发酵时，接种量为10%且种子细胞光密度（OD600）为20左右时，细胞生长的延迟期约为2.11h，细胞生长光密度与培养时间的关系模型为：y=0.7841e^0.2319t（线性相关系数r=0.9936）；在补料发酵时细胞浓度可达115g/L-160g/L（干重），在120h重组人血清白蛋白表达量达3.6g/L。     

Lrrc10蛋白表达载体的构建

为了构建重组质粒pET-Lrrc10和Lrrc10蛋白表达,利用Nco Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切载体pMD18-T-Lrrc10,回收目的片段与经同样酶切后的表达载体pET-30a(+),转入E.coli strainDH5α,菌落PCR筛选阳性菌落,提取阳性菌质粒并进行PCR和酶切鉴定;将重组子转入E.coli strain BL21(DE3),于37℃振荡培养,用1 mmol/L IPTG诱导目的蛋白的表达。结果表明,成功构建了融合表达载体并命名为pET-Lrrc10。转入E.coli strain BL21(DE3)进行目的蛋白的表达,获得与预期分子量大小相一致的融合表达蛋白Lrrc10;Lrrc10蛋白以包涵体形式存在于宿主菌中,且IPTG诱导4小时,目的蛋白表达量最大。     

重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体基因的克隆及工程菌的构建与鉴定

利用RT-PCR技术,从人脐带静脉上皮细胞中克隆人组织型纤溶酶原激活剂基因,将其接入TA克隆载体PCR2．1中,经DNA序列测定后,以该重组质粒DNA为模板,用PCR方法获得了人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)基因,将其转入pET29a,构建了重组表达质粒pET29a／K2tPA,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,构成工程菌．经IPTG诱导表达,在40kDa处有一明显表达条带,表达量为约占菌体总蛋白的20％．该菌种在贮存与复苏及传代过程中具有良好的质粒稳定性和表达稳定性．     

bFGF真核表达载体构建及表达

旨在构建可在哺乳细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子（basic Fibroblast Growth Factor,简称bFGF）的真核表达载体，以便用于研究bFGF基因治疗在骨组织工程中的应用，应用基因重组技术，将已经克隆的bFGF基因从PBR322－bFGF载体上亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1上，构建的重组质粒经脂质体介导转染3T3细胞，36h后观察瞬时表达情况，酶切，PCR和DNA测序结果均证实了插入片段的正确性，免疫组织化学检测bFGF的表达分泌情况，结果显示部分经转染的细胞呈阳性（棕色颗粒）。结果表明已成功构建了bFGF真核表达载体pcDNA3.1-bFGF，并且bFGF能够在3T3细胞表达。     

人白细胞介素-15表达菌株的构建

从健康人外周血分离单核细胞,并提取总RNA,利用RT-PCR扩增出白细胞介素15(IL-15)基因.构建了重组表达菌株BL21(DE3)(pET28c(+)-IL-15).经酶切鉴定和序列测定证实,构建的重组质粒(pET28c(+)-IL-15)含有IL-15基因.经Western blot鉴定证实为IL-15,并实现了在大肠杆菌中的高效表达.表达产物占菌体总蛋白的32%,从而为进一步研究IL-15的生物学功能和临床应用奠定了基础.     

全长人lrp基因及其截短和定点突变体真核表达载体的构建

为了对脂多糖应答基因（lrp）的功能进行深入的研究,实验用PCR及双PCR法扩增出lrp基因的截短体（lrp△C）和突变体（lrpm）序列,测序正确后将正常lrp基因及其截短体和突变体序列均连入真核表达载体pcDNA3．1（＋）,构建重组质粒pcDNA3．1（＋）-lrp、pcDNA3．1（＋）-lrp△C和pcDNA3．1（＋）-lrpm。DNA测序结果显示,PCR反应成功得到了lrp基因的截短体和突变体序列;重组质粒酶切鉴定结果显示：人lrp基因及其截短体、突变体成功连入了真核表达载体pcDNA3．1（＋）。     

人组氨酰-tRNA合成酶基因的克隆与表达

用RT-PCR方法从人胎盘总RNA中获得编码人组氨酰-tRNA合成酶(Jo-1)基因的全序列,选用IMPACT-CN系统中的pTYB11,构建克隆与表达载体,转化大肠杆菌ER2566.经筛选与鉴定,得到3个阳性重组子,对其进行诱导表达获得Jo-1融合蛋白,western-blotting检验结果显示,该融合蛋白具有Jo-1免疫原性和免疫特异性.